冀保衛(wèi) 陳麗華 陳治標(biāo) 蔡 強(qiáng)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院1 神經(jīng)外科，2 麻醉科，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：jbw2002@whu.edu.cn)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率高，約占成人原發(fā)顱內(nèi)腫瘤的80%。目前臨床上多采用以手術(shù)為主的綜合方法治療腦膠質(zhì)瘤，但其預(yù)后仍較差，死亡率高[1-2]。近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的治療帶來(lái)曙光，目前已在多種腫瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的存在[3-5]。已有研究證實(shí)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞較普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性，是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因，但目前尚無(wú)可靠方法有效殺傷體內(nèi)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞[6-8]。因此，探索針對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的靶向治療方法意義重大。組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較好治療作用的新型抗腫瘤藥物[9]，已被證實(shí)能顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[10]。本研究探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 膠質(zhì)瘤母細(xì)胞標(biāo)本來(lái)源于2017年1月至2017年12月武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科收治的22例腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)中切除的腫瘤組織。其中男性12例，女性10例，年齡(56±2)歲，納入標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為膠質(zhì)瘤母細(xì)胞，排除病理性質(zhì)不明確的標(biāo)本。獲取標(biāo)本前已獲得患者及家屬同意。本研究獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)/F12培養(yǎng)基(批號(hào)：11320-033)購(gòu)自HyClone公司，特優(yōu)級(jí)胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS；批號(hào)：12483-020)、B27添加劑(批號(hào)：17504044)均購(gòu)自Invitrogen公司，堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF；批號(hào)：100-18B)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF；批號(hào)：100-47)均購(gòu)自PeproTech公司，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF；批號(hào)：GF342)購(gòu)自Millipore公司，MS-275(批號(hào)：S1053)購(gòu)自Selleck公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)(cell counting kit-8；CCK-8，批號(hào)：CK04)試劑盒購(gòu)自Dojindo公司，藻紅蛋白標(biāo)記小鼠抗人CD133單抗(批號(hào)：130-111-079)購(gòu)自Miltenyi公司，抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1單抗(批號(hào)：2922S)購(gòu)自Cell Signaling公司，兔源多抗(批號(hào)：sc-358919)購(gòu)自Santa Cruz公司，碘化丙啶(批號(hào)：ST512)、核糖核酸酶(批號(hào)：ST576)、細(xì)胞裂解液(批號(hào)：P0013)、免疫印跡試驗(yàn)?zāi)z電泳試劑盒(批號(hào)：P0012A)購(gòu)自碧云天公司。

1.3 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及分組 參照文獻(xiàn)[11]的方法分離、培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞：將新鮮腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織剪成大小約1 mm3的組織塊，應(yīng)用胰蛋白酶消化分解，無(wú)菌生理鹽水清洗后獲得膠質(zhì)瘤母細(xì)胞；將細(xì)胞置于無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基(含LIF 10 ng/ml，EGF 20 ng/ml，bFGF 20 ng/ml，B27 20 μl/ml)中于37℃、5% CO2、95%濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)約1周，即可獲得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球；將細(xì)胞球吹散稀釋后再培養(yǎng)傳代，傳代后仍在無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集第4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。成功分離出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后將其分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)調(diào)整細(xì)胞濃度，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)單位體積懸液內(nèi)細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×104個(gè)/ml，接種于96孔板中，200 μl/孔，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對(duì)照組每孔加入等體積PBS。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μl，37℃避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中各孔吸光度(A值)，依據(jù)如下公式計(jì)算增殖抑制率：抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。每組設(shè)置10復(fù)孔。增殖抑制率=0表示藥物無(wú)作用，增殖抑制率<0表示藥物可促進(jìn)細(xì)胞增殖，增殖抑制率>0表示藥物抑制細(xì)胞增殖。

1.4.2 單克隆法檢測(cè)單克隆形成率：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，使用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)單位體積懸液內(nèi)細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為0.5×103個(gè)/ml，接種于96孔板中，每孔200 μl，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對(duì)照組每孔加入等體積PBS。觀察并計(jì)數(shù)只有1個(gè)細(xì)胞的孔，然后置于無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中于37℃，5% CO2，95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周后計(jì)數(shù)形成細(xì)胞球的孔數(shù)，與培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)單個(gè)細(xì)胞孔總數(shù)的比值，即為克隆形成率。重復(fù)測(cè)定5次，取平均值?？寺⌒纬陕氏陆荡砭邆涓杉?xì)胞特性的細(xì)胞比例下降。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+細(xì)胞含量：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤干細(xì)胞均勻懸浮于含MS-275的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，按照2×105個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞于6孔板中，兩組各3孔，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對(duì)照組每孔加入等體積PBS，置于37℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，PBS洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度約1×106個(gè)細(xì)胞/100 μl，加入藻紅蛋白標(biāo)記的CD133試劑5 μl/100 μl，避光4℃孵育30 min，稀釋至細(xì)胞濃度為約5×105個(gè)細(xì)胞/ml，采用貝克曼公司XL型流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133+細(xì)胞含量。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞于6孔板中，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對(duì)照組每孔加入等體積PBS后于37℃、5% CO2、95%濕度下孵育48 h， PBS洗滌1次，加入碘化丙啶和核糖核酸酶，室溫下避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。細(xì)胞周期分為G0/G1、S、G2/M3期。

1.4.5 免疫印跡試驗(yàn)法檢測(cè)Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤干細(xì)胞按照2×105個(gè)/孔的密度接種細(xì)胞于6孔板中，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10 nmol/ml MS-275，對(duì)照組每孔加入等體積PBS后于37℃、5% CO2、95%濕度下孵育48 h，收集細(xì)胞，加入300 μl細(xì)胞裂解液，4℃下孵育30 min，收集裂解物，4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清，二喹啉甲酸法檢測(cè)蛋白濃度。按50 μg/孔上樣，行常規(guī)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%牛奶室溫下封閉2 h，一抗封閉4℃過(guò)夜，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入按1 ∶6 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，電化學(xué)發(fā)光液室溫孵育約30 s，避光顯影于X線膠片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用QuantityOne Basic軟件計(jì)算免疫印跡蛋白條帶灰度值，以肌動(dòng)蛋白作為參照，獲得兩組相對(duì)灰度值，即為兩組Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用(x±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖能力的比較 實(shí)驗(yàn)組A值為(0.790±0.212)，低于對(duì)照組的(1.102±0.620)(t=2.402，P=0.042)，細(xì)胞增殖抑制率為(28.30±0.72)%。

2.2 兩組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞單克隆形成率比較 實(shí)驗(yàn)組克隆形成率為(32.284±0.011)%，低于對(duì)照組的(87.261±0.002)%(t=4.592，P=0.009)。

2.3 兩組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞CD133+細(xì)胞含量比較 實(shí)驗(yàn)組CD133+細(xì)胞含量為(29.485±1.106)%，低于對(duì)照組的(89.210±1.120)%(t=10.320，P=0.001)。

2.4 兩組各細(xì)胞周期細(xì)胞比例比較 實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例高于對(duì)照組，S期細(xì)胞比例低于對(duì)照組(均P<0.05)，兩組G2/M期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組各細(xì)胞周期細(xì)胞比例比較(x±s，%)

2.5 兩組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 實(shí)驗(yàn)組Cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.426±0.325)，低于對(duì)照組的(0.561±0.234)(t=3.273，P=0.048)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的Cyclin D1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

近年來(lái)，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為腦膠質(zhì)瘤的治療提供了新的研究方向。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是腦膠質(zhì)瘤的起源細(xì)胞之一，如能有效抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖或促進(jìn)其死亡，則有望延遲腦膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)，甚至治愈腦膠質(zhì)瘤。但目前針對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行治療的效果尚不能令人滿意[8]。組蛋白去乙?；敢种苿┍粡V泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療研究，其對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞也有一定的治療效果[10]，但對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是否具有殺傷作用，目前的研究證據(jù)尚不充分，還需要進(jìn)一步研究。

本研究旨在分析組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275干預(yù)后腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生物學(xué)變化。根據(jù)本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，將MS-275終濃度定位為10 nmol/ml[12]。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率近30%，提示經(jīng)MS-275干預(yù)后，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖能力明顯降低，生長(zhǎng)緩慢，這與MS-275對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用類(lèi)似[12]。單克隆性與CD133表達(dá)陽(yáng)性是腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的主要生物學(xué)特性，也是區(qū)別于普通膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特征，常被用來(lái)作為鑒定腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組克隆形成率及CD133+細(xì)胞含量均低于對(duì)照組(均P<0.05)，說(shuō)明經(jīng)MS-275干預(yù)后，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞單克隆形成能力下降，細(xì)胞不再具有無(wú)限增殖能力，體內(nèi)成瘤的潛在能力下降，并趨向分化。

為探討MS-275抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例高于對(duì)照組(P<0.05)，表明經(jīng)MS-275干預(yù)后，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖被阻滯于G0/G1期。調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白較多，其中Cyclin D1蛋白主要參與細(xì)胞周期G1調(diào)控，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，推動(dòng)細(xì)胞周期由G1時(shí)期進(jìn)入到S時(shí)期[14]。研究表明，Cyclin D1是一種原癌基因，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控而發(fā)生惡變[15]，也可結(jié)合組蛋白去乙?；福龠M(jìn)其基因轉(zhuǎn)錄[16]。本研究中，經(jīng)MS-275干預(yù)后腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)下降，這可能是導(dǎo)致MS-275干預(yù)后腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯于G1期的原因。因此，MS-275抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的原因可能為：(1)通過(guò)下調(diào)Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，使腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞不能從G1期進(jìn)入到S期；(2) 抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞內(nèi)組蛋白去乙?；傅牟糠只钚?，阻止Cyclin D1與組蛋白去乙?；傅慕Y(jié)合，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。

研究表明，組蛋白去乙?；种苿┠軓亩鄺l途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，如MS-275能使腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性下降、遷移受阻；通過(guò)抑制信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3磷酸化誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；還可通過(guò)抑制IκB-α的磷酸化水平進(jìn)而抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活性、誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞U266發(fā)生凋亡等[17-20]。MS-275對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖的抑制作用是否與上述機(jī)制有關(guān)，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275能抑制腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其分化，其機(jī)制可能與MS-275降低腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Cyclin D1蛋白表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞周期受阻滯有關(guān)。