羅燕飛 布力布麗·巴哈提 米熱古麗·買買提 曹 晨 梁 玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，烏魯木齊市 830054，電子郵箱：13669905477@163.com)

生長激素是通過腺垂體分泌的一種肽類激素，在人體中具有重要的生理作用，其通過對(duì)骨骼、肌肉、肺臟、肝臟和腎臟等器官的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響人體各個(gè)系統(tǒng)生長、發(fā)育和代謝[1-2]。生長激素主要通過兩種機(jī)制作用于人體，而這兩種機(jī)制都以生長激素與靶細(xì)胞膜上的生長激素受體相結(jié)合進(jìn)而激活各自的信號(hào)通路。一種機(jī)制是與生長激素受體結(jié)合后激活Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)信號(hào)通路，另一種機(jī)制是與生長激素受體結(jié)合后激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路[3]。鑒于生長激素對(duì)人體的重要性，本研究分析生長激素不同刺激方式對(duì)大鼠JAK/STATS信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取7日齡的健康Wistar大鼠共78只，其中雄性38只、雌性40只，體重(360.52±6.41)g，均來源于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(新)2013-0001。用電子天平稱其重量，并測(cè)量其身長，計(jì)算Lee指數(shù)(即肥胖評(píng)定指數(shù))，Lee指數(shù)=[體重(g)]1/3×1000/體長(cm)。實(shí)驗(yàn)開始前，4組大鼠的體重、Lee指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 4組大鼠的體重及Lee指數(shù)比較(x±s)

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 Benchmark Plus全波長自動(dòng)酶標(biāo)儀(上海新振儀器設(shè)備有限公司)，BP211D型電子分析天平(美國Sartorius公司)，Milli-Q Biocei型超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，1-14K型高速低溫離心機(jī)(德國Sigma公司)，C1000型PCR儀(美國Bio-Rad公司)，DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)。D12492超高脂飼料(美國Research Diets公司)，磷酸緩沖鹽溶液(美國Invitrogen公司)，重組人生長激素(recombinant human growth hormone,rhGH；長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：S20000001)，RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex TaqⅢ試劑盒(TaKaRa公司生產(chǎn)，DRR041A)。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 肥胖大鼠模型的建立 將大鼠按照增脂飲食飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件為無特定病原體級(jí)，室溫20℃～22℃，自然光線，自由飲水進(jìn)食7 d后采用D12492超高脂飼料(59.9%脂肪、20%蛋白質(zhì)、20.1%碳水化合物)喂養(yǎng)4周，使其體重達(dá)320～350 g，即模型建立成功。最終共獲得60只飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠，建模成功率為76.92%(60/78)。

1.4 分組及干預(yù)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將肥胖模型大鼠分為A、B、C、D組，每組15只，分別給予磷酸緩沖鹽溶液2 ml/d、rhGH 0.1 IU/(g·d)、rhGH 0.2 IU/(g·d)、rhGH 0.3 IU/(g·d)肌肉注射，1次/d，同等條件下飼養(yǎng)，2周后處死，其中每組采用隨機(jī)數(shù)字表法選取7只在處死前30 min注射1 IU/g的rhGH。

1.5 標(biāo)本的獲取 10%水合氯醛麻醉大鼠后解剖其腹腔，取出肝臟、腎臟周圍和皮下周圍的部分脂肪，用濾紙吸去表面的組織液，使用4℃磷酸緩沖液沖洗后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 JAK2與STAT5 mRNA表達(dá)的檢測(cè)方法 (1)總RNA提?。悍Q取肝、腎及脂肪組織各50 mg，混合后用于抽提總RNA，液氮預(yù)冷后迅速碾壓成粉末，加入Trizol試劑使組織充分裂解，室溫靜置后進(jìn)行分離(2 500 r/min,-20℃,30 min)；沉淀、漂洗和再溶解，置于-80℃冰箱中保存。(2)RNA濃度及純度測(cè)定：用焦碳酸二乙酯水為空白對(duì)照，分光光度計(jì)測(cè)定讀取A260和A280，并計(jì)算A260和A280的比值。(3)引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用Oligo 6.71 Demo軟件輔助設(shè)計(jì)引物，JAK2 上游引物為(5′-3′)GCT CAG TGG CGG CAT GAT，下游引物為CAC TGC CAT CCC AAG ACA TTC；STAT5上游引物為(5′-3′)CCC TTC CCG TGG TTG T，下游引物為(5′-3′)ATG CCG TTG TAG TCC TC；內(nèi)參c-Myc上游引物為(5′-3′)ATG CCC CTC AAC GTT AGC，下游引物為(5′-3′)AGC TCG CTC TGC TGC TGC。(4)循環(huán)參數(shù)：① JAK2：反應(yīng)體系20 μl；變性溫度95℃，40 s，退火溫度51.3℃，復(fù)性時(shí)長40 s，循環(huán)次數(shù)30次。② STAT5：反應(yīng)體系20 μl；變性溫度95℃，40 s，退火溫度51.0℃，復(fù)性時(shí)長40 s，循環(huán)次數(shù)30次。③ c-Myc：反應(yīng)體系20 μl；變性溫度95℃，40 s，退火溫度55.0℃，復(fù)性時(shí)長40 s，循環(huán)次數(shù)30次。應(yīng)用C1000型PCR儀收集各個(gè)基因的Ct值。(5)計(jì)算相對(duì)表達(dá)量：使用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。使用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠JAK2 mRNA基因相對(duì)表達(dá)水平比較 與A組相比，其他3組大鼠的JAK2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均下降(均P<0.05)；隨著rhGH劑量的上升，B、C、D組的JAK2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平下降(r=-0.941，P<0.001)。各組內(nèi)處死前注射rhGH及未經(jīng)處理的大鼠間JAK2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠JAK2 mRNA基因相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：組間兩兩比較均P<0.05。

2.2 4組大鼠STAT5 mRNA基因表達(dá)水平比較 與A組相比，其他3組大鼠的STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(均P<0.05)；且隨著rhGH劑量的增加，B、C、D組的STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(rs=-0.956，P<0.001)。各組內(nèi)處死前注射rhGH及未經(jīng)處理的大鼠間STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 4組STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：組間兩兩比較均P<0.05。

3 討 論

JAK/STAT信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)始于生長激素受體與生長激素的相結(jié)合，生長激素受體通過二聚體的形式與生長激素結(jié)構(gòu)中的單環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，然后可激活自身與JAK2的磷酸化，磷酸化的JAK2又可以激活生長激素受體，形成交叉磷酸化，二者結(jié)合生長激素共同形成生長激素-生長激素受體-JAK2多聚體，為下游信號(hào)分子提供結(jié)合位點(diǎn)[4-5]。國外研究結(jié)果顯示JAK/STAT信號(hào)通路能夠?yàn)槎喾N細(xì)胞因子提供傳導(dǎo)途徑，但多種細(xì)胞因子也可以抑制JAK/STAT信號(hào)通路[6]，其機(jī)制已基本清楚，但其如何在傳導(dǎo)過程中進(jìn)行調(diào)控及不同濃度生長激素長期刺激機(jī)體是否會(huì)對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路產(chǎn)生影響有待于繼續(xù)研究。

王娟等[7]發(fā)現(xiàn)小鼠處死前注射單劑量生長激素的小鼠肝細(xì)胞核磷酸化STAT水平及STAT5 DNA的黏附活性均是長期連續(xù)注射生長激素小鼠的2倍，說明rhGH慢性刺激抑制了小鼠JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)注射rhGH 2周的肥胖小鼠的JAK2及STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均低于未注射rhGH的A組(均P<0.05)，提示長期給肥胖小鼠注射生長激素可明顯抑制STATS的激活，進(jìn)而可抑制JAK/STAT信號(hào)通路，這可能是由于長期注射生長激素致使機(jī)體細(xì)胞因子信號(hào)抑制物3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加，從而調(diào)控性抑制JAK-STAT信號(hào)通路。此外，本研究結(jié)果還顯示，隨著rhGH劑量的增加，肥胖大鼠的JAK及STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)(P<0.05)，提示在一定范圍內(nèi)，rhGH注射劑量越大對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的抑制越明顯。

本研究采用短時(shí)間刺激和長期刺激兩種方式對(duì)肥胖大鼠注射rhGH，發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠機(jī)體正常分泌生長激素情況下，長期注射rhGH可抑制肥胖小鼠JAK/STATS的基因表達(dá)水平，但各組內(nèi)處死前注射rhGH及未經(jīng)處理的大鼠間JAK2及STAT5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，提示短時(shí)注射高劑量rhGH對(duì)于肥胖小鼠的JAK及STAT5 mRNA表達(dá)無明顯影響，可能是長期注射rhGH降低了機(jī)體對(duì)處死前注射rhGH刺激的敏感性。如果將處死前注射rhGH視為機(jī)體分泌生長激素的峰值，則進(jìn)行長期注射rhGH刺激或許能夠抑制機(jī)體對(duì)內(nèi)源性生長激素的敏感程度，提示長期注射rhGH能夠抑制JAK/STAT信號(hào)通路，并使機(jī)體對(duì)GH敏感性降低，國內(nèi)相關(guān)研究中也得出相似的結(jié)論[8-9]。因此，我們認(rèn)為生長激素不同的刺激方式對(duì)JAK/STATS信號(hào)通路會(huì)造成不同程度的影響，關(guān)于其各自的相關(guān)機(jī)制和作用位點(diǎn)有待于進(jìn)一步探討。

綜上所述， rhCH慢性刺激可抑制小鼠肝細(xì)胞的JAK/STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且隨著刺激劑量的提高其抑制作用有上升趨勢(shì)，但在此基礎(chǔ)上快速rhCH刺激則無顯著作用。