馬桂娟，朱 捷，湯麗華，謝 芳，王紫昕，朱燕燕

(寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)中心，寧夏銀川 750001)

枸杞是藥食同源的功能性特色植物資源，富含類胡蘿卜素、黃酮類和枸杞多糖等生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于保健食品行業(yè)[1-3]。超臨界 CO2流體萃取的枸杞籽油，也富含類胡蘿卜素、不飽和脂肪酸等成分，從其功能成分上分析，屬于具有保健作用的油脂。目前的藥理研究證實(shí)，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力的作用[4]，其活性成分如枸杞多糖、類胡蘿卜素物質(zhì)均有抗氧化作用。

葉黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃質(zhì)是類胡蘿卜素物質(zhì)中最重要的物質(zhì)之一，廣泛分布于人體多個(gè)組織，對(duì)維持健康起到重要作用。玉米黃質(zhì)和葉黃素具有預(yù)防光損傷和防治老年性黃斑衰退癥的功能。β-胡蘿卜素是一種重要的維生素 A 來(lái)源，通過(guò)攝入 β-胡蘿卜素可以有效地對(duì)維生素 A進(jìn)行補(bǔ)充[5]。因此準(zhǔn)確測(cè)定枸杞干果和枸杞籽油中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素的含量，對(duì)于正確評(píng)價(jià)枸杞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和枸杞籽油功能性成分，開展?fàn)I養(yǎng)學(xué)研究十分必要。高效液相色譜法是測(cè)定多種類胡蘿卜素的方法，在不同的樣品中已有相關(guān)研究報(bào)道[6-8]。但對(duì)枸杞干果及枸杞籽油中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素檢驗(yàn)方法鮮見報(bào)道。筆者建立能同時(shí)測(cè)定枸杞干果及枸杞籽油中3種功能性成分的方法，能夠?yàn)殍坭礁晒拌坭阶延偷馁|(zhì)量控制和質(zhì)量監(jiān)督提供適用的技術(shù)依據(jù)，也為保障枸杞深加工產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試材枸杞購(gòu)于寧夏中寧，枸杞籽油由枸杞籽經(jīng)超臨界 CO2流體萃取制得，樣品于干燥避光處保存。玉米黃質(zhì)(純度≥95%)，美國(guó)ChromaDex公司；β-胡蘿卜素(純度≥97%)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；葉黃素(純度≥95%)，北京曼哈格生物科技有限公司；環(huán)己烷(色譜純)、甲基叔丁基醚(色譜純)、正己烷(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)，賽默飛世爾科技有限公司；乙醚(色譜純)、無(wú)水乙醇(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；二丁基羥基甲苯(BHT，優(yōu)級(jí)純)、氫氧化鉀(優(yōu)級(jí)純)、無(wú)水硫酸鈉(優(yōu)級(jí)純)、抗壞血酸(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有用水均為超純水。

1.2儀器Aglient 1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；IKA KS 4000i恒溫振蕩器，德國(guó)IKA公司；BUCHI V-850旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦實(shí)驗(yàn)室公司；BS 224 S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器公司；均質(zhì)器，德國(guó)IKA公司；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取適量玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷配制成500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用前需校正)；分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量，用0.1% BHT乙醇溶液稀釋成100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液；準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用0.1% BHT乙醇溶液提取液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定由于標(biāo)準(zhǔn)品的來(lái)源、工藝的差異，加上標(biāo)準(zhǔn)品在存儲(chǔ)過(guò)程中受到溫度、氧化等因素的影響，在每次測(cè)定前都應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行濃度標(biāo)定。同時(shí)不同來(lái)源的標(biāo)準(zhǔn)品在不同試劑中有不同的比吸光系數(shù)，標(biāo)定時(shí)應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書選擇各自的比吸光系數(shù)[9]。

玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在配制后，在使用前需要對(duì)其濃度進(jìn)行校正，具體操作如下：取玉米黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(濃度約為500 μg/mL)20 μL，用10.0 mL甲醇稀釋，混勻；采用1 cm比色杯，以甲醇為空白參比，測(cè)定其吸光度。取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(濃度約為500 μg/mL)20 μL，用10.0 mL正己烷稀釋，混勻；采用1 cm比色杯，以正己烷為空白參比，測(cè)定其吸光度。取葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(濃度約為500 μg/mL)20 μL，用10.0 mL無(wú)水乙醇稀釋，混勻；采用1 cm比色杯，以無(wú)水乙醇為空白參比，測(cè)定其吸光度。試液中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素的濃度按公式計(jì)算：X=(A×10.02)/(E×0.02)，式中，X為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度，A為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的吸光度。

表1 測(cè)定波長(zhǎng)及比吸光系數(shù)

1.5樣品前處理

1.5.1試樣制備。稱取200 g枸杞樣品加入400 g水，用均質(zhì)器打漿后備用，枸杞籽油樣品用前振搖或攪拌混勻。

1.5.2試樣皂化。枸杞樣品稱取2 g(精確至0.1 mg)，置于100 mL 具塞離心管中，加入1 g抗壞血酸、0.2 g BHT和30 mL無(wú)水乙醇，于(70±1)℃恒溫振蕩30 min，再加入10 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，蓋上瓶塞。置于已預(yù)熱至(54±2)℃恒溫振蕩箱中，皂化45 min。皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

枸杞籽油試樣：準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.1 mg)，置于250 mL錐形瓶中，加入1 g抗壞血酸、0.2 g BHT和 30 mL無(wú)水乙醇。加入30 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，蓋上瓶塞，置于已預(yù)熱至(54±2)℃恒溫振蕩箱中，皂化45 min。皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

1.5.3試樣萃取。將皂化液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，加入60 mL萃取溶劑(1 g BHT，以200 mL環(huán)己烷溶解，加入400 mL乙醚和400 mL正己烷)，輕輕搖動(dòng)，排氣，蓋好瓶塞，室溫下振蕩10 min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中按上述方法進(jìn)行第2次提取。合并有機(jī)相，用50 mL水洗有機(jī)相5～6次，直至水洗近中性。棄水相，有機(jī)相通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾脫水。濾液收入250 mL蒸發(fā)瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(40±2)℃減壓濃縮至近干(不能蒸干)。用0.1% BHT乙醇溶液，充分溶解提取物并定容至10 mL。經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后供液相色譜儀分析。

1.6液相色譜條件色譜柱為C30色譜柱，250 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)，粒徑5 μm；進(jìn)樣量50 μL；柱溫30.0 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm。流動(dòng)相A為甲醇∶水(88∶12，V/V，含0.1% BHT)，B為甲基叔丁基醚(含0.1% BHT)。梯度洗脫條件見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇通過(guò)對(duì)10 μg/mL的葉黃素、玉米黃質(zhì)及β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行200～600 nm的光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉黃素在445 nm有最大吸收(圖1a)；玉米黃質(zhì)在450 nm有最大吸收(圖1b)；β-胡蘿卜素在450 nm有最大吸收(圖1c)。因此，該方法選擇445 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 葉黃素(a)、玉米黃質(zhì)(b)、β-胡蘿卜素(c)對(duì)照品全波長(zhǎng)掃描曲線Fig.1 Spectrophotomentry chromatogram of standard of lutein(a)，zeaxanthin(b)and β-carotene(c)

2.2流動(dòng)相的確定根據(jù)玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素的化學(xué)性質(zhì)，參考GB5009.248—2016《食品中葉黃素的測(cè)定》[10]中色譜條件，該研究采用YMC C30(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以含0.1%BHT甲醇-水(88∶12)作為A相，含0.1%BHT甲基叔丁基醚作為B相，分離枸杞及枸杞籽油中3種類胡蘿卜素物質(zhì)，葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2。

注：1.葉黃素；2.玉米黃質(zhì)；3.β-胡蘿卜素Note：1.Lutein；2.Zeaxanthin；3.β-carotene圖2 葉黃素、玉米黃質(zhì)和β-胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms for zeaxanthin，β-carotene and lutein

2.3提取方式的確定枸杞子含有大量多糖成分，粉碎易結(jié)塊，枸杞復(fù)水勻漿處理，可使枸杞中部分糖分溶解。同時(shí)對(duì)于枸杞植物細(xì)胞壁較厚的樣品，在試樣中先加入乙醇于60～80 ℃回流后再提取，可提高提取效果[9]。因此該研究將枸杞樣品于70 ℃乙醇溶液中回流之后再皂化。

皂化是類胡蘿卜素前處理的一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。對(duì)于枸杞籽油脂肪成分過(guò)高的油脂樣品，可采用皂化方式提純凈化；此外枸杞中大部分類胡蘿卜素以酯化形式存在[11-12]，皂化可使枸杞類胡蘿卜素酯成為游離態(tài)的類胡蘿卜素，這樣可以簡(jiǎn)化色譜的分離。但由于類胡蘿卜素對(duì)光、熱、氧不穩(wěn)定，在提取過(guò)程可通入氮?dú)?，加入抗壞血酸和BHT等抗氧化劑起到保護(hù)作用。

采用乙醚、乙醚-石油醚、乙醚-正己烷-環(huán)己烷為提取溶劑進(jìn)行液液萃取對(duì)比試驗(yàn)，其中用乙醚、乙醚-石油醚為提取溶劑時(shí)，葉黃素的回收率僅為20%～30%，而用乙醚-正己烷-環(huán)己烷為提取溶劑，3種物質(zhì)的提取效果回收率最高。因此將乙醚-正己烷-環(huán)己烷作為提取試劑。

2.4線性范圍和檢測(cè)限在選定的儀器條件下進(jìn)行色譜分析，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定 3 次，測(cè)得峰面積平均值對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表3可看出，玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素及葉黃素在其相應(yīng)的線性范圍表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表3 3種類胡蘿卜素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

2.5回收率與精密度精密稱取枸杞籽油、枸杞樣品各6份，每份樣品中分別加入3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按“1.5”操作方法進(jìn)行處理，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表4)，回收率為70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于 10%，可以滿足日常監(jiān)測(cè)中3種類胡蘿卜素分析的準(zhǔn)確度與精密度要求。

表4 枸杞和枸杞籽油中3種類胡蘿卜素的回收率和精密度試驗(yàn)(n=6)

3 結(jié)論

該研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定枸杞干果及枸杞籽油中玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和葉黃素的檢驗(yàn)方法。該方法前處理操作簡(jiǎn)單、皂化時(shí)間短、凈化效果好，能夠滿足枸杞干果及枸杞籽油中3種類胡蘿卜素的定性和定量分析，可用于實(shí)際樣品的分析。