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(合肥工業(yè)大學 食品科學與工程學院，合肥 230009)

中華絨螯蟹(EriocheirsinensisMilne-Edwards)別名大閘蟹、河蟹、毛蟹等，以其螯足密生絨毛得名[1]。河蟹是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，其養(yǎng)殖已經(jīng)遍布全國，但主產(chǎn)區(qū)集中在江蘇、湖北、安徽、遼寧等省份(我國河蟹產(chǎn)量最大的4個省份)[2]。已有的研究認為，中華絨螯蟹蟹肉鮮美細嫩，并且具有舒筋益氣、理胃消食、活血化瘀、通經(jīng)絡、散諸熱等功效[3]。

揮發(fā)性物質(zhì)是指一類能為人體感覺器官所感知的揮發(fā)性的低分子質(zhì)量化合物[4]，通常需在一定條件下(如加熱、酶催化等)，由風味前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來，目前在水產(chǎn)品中經(jīng)鑒定得到的揮發(fā)性物質(zhì)已達上千種之多[5]。水產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)研究的進展很大程度上歸功于揮發(fā)性混合物中氣味化合物的分離、檢測和鑒定等研究技術的發(fā)展。頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS) 技術可以成功分離和鑒定復合物中的揮發(fā)性化合物，同時具有高靈敏度和強抗干擾能力，被廣泛應用于食品香氣分析[6，7]。電子鼻(E-nose)主要由采樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成，它可以為復雜食品樣本中不同揮發(fā)性化合物的混合物提供不同的響應[8]，得到樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的整體信息，具有客觀、準確、重復性好及無損等優(yōu)點[9]。將電子鼻結合頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術對揮發(fā)性物質(zhì)進行定性定量分析，能進一步推動食品中揮發(fā)性物質(zhì)的研究。

近年來，國內(nèi)已有不少學者對中華絨螯蟹蟹肉的風味品質(zhì)進行了比較研究，如顧賽麒等比較了松江、陽澄湖和崇明三地熟制中華絨螯蟹蟹肉中的揮發(fā)性成分[10]；Zhuang等研究比較了天然膳食、傳統(tǒng)飲食和配方飼料3種喂養(yǎng)方式喂養(yǎng)的雌性中華絨螯蟹的蟹肉和肝胰臟的風味物質(zhì)[11]。然而，還未見有對我國四大主產(chǎn)區(qū)養(yǎng)殖的中華絨螯蟹蟹肉進行揮發(fā)性物質(zhì)的比較研究。鑒于此，本文采用HS-SPME-GC-MS和E-nose技術比較了安徽當涂、江蘇泗洪、湖北洪湖和遼寧盤錦4個地區(qū)雌、雄中華絨螯蟹蟹肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類與含量，期望為后續(xù)構建完整的中華絨螯蟹風味物質(zhì)數(shù)據(jù)庫提供相關實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

分別從我國4個地區(qū)，即江蘇泗洪(規(guī)格：雄蟹150～170 g；雌蟹100～120 g)、湖北洪湖(規(guī)格：雄蟹150～170 g；雌蟹100～120 g)、安徽當涂(規(guī)格：雄蟹150～170 g；雌蟹100～120 g)和遼寧盤錦(規(guī)格：雄蟹80～100 g；雌蟹60～80 g)取雌雄蟹各20只，活蟹捕撈出水后立即用麻繩扎緊，放置入底部鋪有冰袋的泡沫箱內(nèi)，迅速帶回實驗室，于4 ℃保藏。

萃取頭(碳分子篩(CAR)/二甲基硅氧烷(PDMS)/75 μm)，手動進樣手柄 德國Sigma公司；PEN3電子鼻 德國Airsense公司；5975C-7890A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB-5MS色譜柱(60 m×0.32 mm×1 μm) 美國Agilent公司；HH-2數(shù)顯水浴鍋 江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將捆扎好的雌、雄蟹用自來水反復沖洗(清除表面的泥沙等雜質(zhì))多次后，置于不銹鋼鍋中隔水于100 ℃蒸煮20 min。取出蒸熟的蟹樣，冷卻至室溫，解剖后取出肌肉，并充分絞碎混合均勻，精確稱取每份質(zhì)量為(2.00±0.01) g和(5.00±0.01) g的肉樣，分別裝入10 mL的電子鼻進樣瓶和20 mL的頂空瓶中備用。

1.2.2 電子鼻檢測

各組進樣瓶在60 ℃下平衡600 s后利用電子鼻檢測，以潔凈、干燥的空氣為載體，氣體流量400 mL/min，采樣間隔1 s，清洗時間150 s，歸零時間5 s，預進樣時間150 s，測量時間100 s。檢測在相同條件下重復5次。

1.2.3 GC-MS檢測

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)分離揮發(fā)性物質(zhì)。將老化后的萃取頭通過隔膜插入，并暴露于頂空瓶的頂部空間，經(jīng)100 ℃水浴加熱提取40 min進行預處理，將吸附完成的萃取針由氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)注射口240 ℃解吸5 min后進樣分析。

色譜條件：揮發(fā)性化合物的分析通過GC-MS系統(tǒng)進行。對每個蟹肉樣品，利用GC-MS檢測，重復3次。色譜柱為DB-5MS柱(60 m×0.32 mm×1 μm)；使用氦氣(99.999%)作為載氣，流量為1 mL/min；不分流進樣；升溫程序：起始溫度為40 ℃，先以5 ℃/min升至100 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃，最后以5 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；汽化室溫度240 ℃。

質(zhì)譜條件：檢測器接口溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；電離能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍40～450 amu/s；電子倍增器電壓1576 V；掃描速度1.8 s-1。

定性定量方法：氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用NIST 2008數(shù)據(jù)庫進行定性分析，僅報道化合物正反匹配度大于80(最大值為100)的鑒定結果。將內(nèi)標2,4,6-三甲基吡啶(TMP)溶解在甲醇中，以使最終濃度為1000 mg/L，并在進行SPME過程之前，將1 μL該溶液加入到5 g均質(zhì)樣品中。通過峰面積比(分析物/內(nèi)標)與數(shù)量比(分析物/內(nèi)標)的標準曲線確定揮發(fā)性化合物的濃度。在這項研究中，我們使用TMP作為內(nèi)標不考慮標準曲線，即校準系數(shù)都假定為1.00[12]。 蟹樣品中每種揮發(fā)性化合物的濃度計算公式如下：

式中：V1為揮發(fā)物的峰面積；V2為內(nèi)標的峰面積；1為內(nèi)標的含量(μg)；5為樣品的質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

電子鼻數(shù)據(jù)由儀器自帶的WinMuster軟件采用主成分分析法(PCA)處理；GC-MS數(shù)據(jù)采用NIST 2008數(shù)據(jù)庫進行定性分析；其他試驗結果均采用SSPS 19.0軟件進行計算。

2 結果與分析

2.1 4個地區(qū)蟹肉風味的電子鼻分析

PCA(principal component analysis)是將多個傳感器所得到的信息進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維(重復的變量刪去，建立盡可能少的新變量，使得這些新變量兩兩不相關)，并對降維后的特征向量進行線性分類，結果顯示主要的兩維散點圖[13]。4個地區(qū)蟹肉電子鼻數(shù)據(jù)PCA分析圖見圖1，其中每個橢圓區(qū)域代表同一地區(qū)同一性別樣品的數(shù)據(jù)采集點。

圖1 4個地區(qū)蟹肉電子鼻數(shù)據(jù)PCA分析圖Fig.1 Principal component analysis chart for E-Nose data of crab meat from four regions

由圖1可知，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的貢獻率之和為99.28%，大于85%，表明PC1和PC2可以較好地表征樣品整體的風味特征。同時，不同蟹肉樣品的電子鼻數(shù)據(jù)組之間無重疊，表明其區(qū)分度也較好。

由圖1還可知，不僅代表不同雌、雄蟹肉樣品的橢圓可明顯區(qū)分開，且不同地區(qū)蟹肉數(shù)據(jù)的分布也存在一定規(guī)律性，即安徽當涂蟹肉的香氣較為特殊，其數(shù)據(jù)點與其他3個地區(qū)的數(shù)據(jù)點距離較遠，且差異主要體現(xiàn)在第一主成分軸上，PC1貢獻率達97.37%，可較好地反映原始高維矩陣數(shù)據(jù)的信息。

2.2 4個地區(qū)蟹肉的 GC-MS 分析

2.2.1 4個地區(qū)蟹肉氣味主體分析

利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用儀對安徽當涂、江蘇泗洪、湖北洪湖、遼寧盤錦4個地區(qū)的雄蟹和雌蟹肌肉揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測，結果見表1和表2。

表1 4個地區(qū)雄蟹肌肉揮發(fā)性成分分析Table 1 Analysis of volatile compounds of male crab meat from four regions

續(xù) 表

續(xù) 表

注：同行字母不同表示有顯著性，相同則表示無顯著性(P<0.05)；“-”表示未檢出。

表2 4個地區(qū)雌蟹肌肉揮發(fā)性成分分析Table 2 Analysis of volatile compounds of female crab meat from four regions

續(xù) 表

注：同行字母不同表示有顯著性，相同則表示無顯著性(P<0.05)；“-”表示未檢出。

本次試驗共分離鑒定出91種化合物：烴類芳香族25種，醇類12種，酮類8種，醛類16種，酯類16種，含N類化合物4種，其他化合物10種。從4個地區(qū)雄蟹中分別檢測出33，31，28，24種揮發(fā)性風味化合物；而從雌蟹中分別檢測出35，29，25，30種揮發(fā)性風味化合物。

2.2.2 化合物種類及風味特征

烴類芳香族：4個地區(qū)雄蟹肌肉揮發(fā)性組分中，烴類芳香族化合物含量分別為809.13 ng/g(安徽當涂)、716.99 ng/g(江蘇泗洪)、423.34 ng/g(湖北洪湖)和298.89 ng/g(遼寧盤錦)；雌蟹肌肉揮發(fā)性組分中，烴類芳香族化合物含量分別為1404.12 ng/g(安徽當涂)、639.53 ng/g(江蘇泗洪)、465.07 ng/g(湖北洪湖)和117.15 ng/g(遼寧盤錦)。烴類芳香族化合物具有高芳香閾值，需要在高濃度下才能引起嗅覺反應，一般認為對食品整體風味的貢獻較小[14]。有較多報道指出2,6,10,14-四甲基十五烷具有清甜的香味，在4個地區(qū)的河蟹肌肉中均被檢測到，這可能是中華絨螯蟹風味較好的原因之一[15]，且安徽當涂雄蟹和雌蟹肌肉中，該化合物含量分別高達379.23 ng/g和871.75 ng/g，遠遠高于其他地區(qū)。本次試驗還檢測出含量較高的對二甲苯，雄蟹肌肉中含量分別為72.18 ng/g(安徽當涂)、47.03 ng/g(江蘇泗洪)、79.16 ng/g(湖北洪湖)和20.80 ng/g(遼寧盤錦)，雌蟹肌肉中含量分別為53.83 ng/g(安徽當涂)、117.56 ng/g(江蘇泗洪)、105.07 ng/g(湖北洪湖)和36.59 ng/g(遼寧盤錦)，但相關文獻指出，烷基苯類化合物可能存在于環(huán)境中的污染物，具有刺激性氣味。此外，僅在湖北洪湖和安徽當涂檢測出少量萘，可能來自外界環(huán)境。

醇類化合物：醇類化合物可能由脂肪酸的二級氫過氧化物的分解、脂質(zhì)氧化酶對脂肪酸的作用生成或由羰基化合物還原生成[16]。醇類是一種高閾值化合物[17]，一般具有酸敗、土腥味或花香味，對食物的風味影響不大。但有些長直聯(lián)醇或是不飽和的烯醇閾值較低，也可能對食品風味有較大貢獻。雄蟹肌肉中共檢測到4-十二碳烯醇、1-辛烯-3-醇、3-壬烯-1-醇3種不飽和醇，其中1-辛烯-3-醇是一種酯類降解產(chǎn)物[18]，是甲殼類動物的主要揮發(fā)性醇，具有蘑菇、青草和泥土氣味[19]，且遼寧盤錦雄蟹肌肉中該醇含量高達73.44 ng/g。值得注意的是，遼寧盤錦雌蟹肌肉中該醇的含量也較高，為53.49 ng/g，可能與養(yǎng)殖水域環(huán)境有關。

酮類化合物：酮類化合物多為脂質(zhì)受熱氧化和降解的產(chǎn)物，貢獻甲殼綱魚肉甜的花香和果香風味，具有濃郁的近似玫瑰葉的香味，且隨著碳鏈的延長，花香味也逐漸增加，伴有一種青葉的芳香氣味[20]。雄蟹肌肉中共檢測到3種酮類，2-壬酮呈果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味[21]，安徽當涂、湖北洪湖、遼寧盤錦均檢測到2-壬酮，其中遼寧盤錦雄蟹蟹肉中含量高達278.80 ng/g，遠遠高于其他地區(qū)。雌蟹肌肉中共檢測到8種酮類，僅在遼寧盤錦雌蟹肌肉中檢測到2-壬酮，且遼寧盤錦雄蟹肌肉酮類總含量最高。烯酮類也是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，由肉制品在加熱期間生成，具有青草的氣味[22]。本次試驗在安徽當涂河蟹肌肉中檢測到1-辛烯-3-酮，具有很濃厚的似玫瑰葉香，該烯酮在鋸緣青蟹(Scyllaserrata)中也被檢測到[23]。

醛類化合物：醛類是由不飽和脂肪酸氧化以及氨基酸斯特蕾克爾(Strecker)降解產(chǎn)生的一類低閾值呈味物質(zhì)，具有氣味疊加效應，也是存在于食品中的一類重要風味化合物。低分子量的醛具有油香、脂香、清香氣味，較高分子量的醛具有橘子皮似的氣味。苯甲醛是由Strecker氨基酸反應生成的，具有杏仁香、堅果香和水果香，在蝦尾肉和蟹肉的風味特征中起重要作用，結果表明，安徽當涂和湖北洪湖兩地的雄蟹肌肉苯甲醛含量較高，且安徽當涂和遼寧盤錦兩地雌蟹肌肉苯甲醛含量較高。壬醛和庚醛已被證實為多種魚類的典型腥味物質(zhì)，4個地區(qū)蟹肉均檢測到壬醛，其中安徽當涂河蟹肌肉中壬醛含量最高，雄蟹和雌蟹肌肉中分別達到156.82，221.53 ng/g；除此之外，4個地區(qū)蟹肉均檢測到庚醛，且安徽當涂河蟹肌肉中的含量略高于其他地區(qū)，這可能是安徽當涂蟹肉土腥味高于其他地區(qū)的原因之一。

酯類化合物：酯類化合物是由低級飽和單羧酸或多數(shù)不飽和單羧酸與飽和醇或不飽和醇酯化后的產(chǎn)物，具有令人愉悅的水果香氣，對蟹肉的風味特征具有重要風味貢獻。安徽當涂蟹肉檢測到的酯類含量最高，分別為雄蟹73.24 ng/g和雌蟹59.23 ng/g。在江蘇泗洪蟹肉中檢測到乙酸己酯，這也可能是該地區(qū)蟹肉風味的貢獻者，呈清香、甜香和果香香氣。

含N類化合物：含N類化合物主要來源于蛋白質(zhì)、游離氨基酸和核酸的分解[24]。在安徽當涂雄蟹肌肉中檢測到一種含N類化合物，為3-丁烯酰胺，含量為0.86 ng/g；在江蘇泗洪蟹肉中檢測到一種含N類化合物，為甲基烯丙基胺，含量為1.83 ng/g；而在遼寧盤錦雄蟹和雌蟹肌肉中均檢測到甲氧基苯基肟，含量分別為14.10，54.48 ng/g，其具體風味特征需要進一步的研究。

其他化合物：其他化合物中主要包括醚類、酚類、呋喃和酸酐。醚類化合物具有獨特的氣味，4個產(chǎn)地蟹肉中均檢測到醚類，如遼寧盤錦雌蟹肌肉中檢測到二甲基硫醚，有報道稱該物質(zhì)產(chǎn)生熟蛤與熟牡蠣的香味[25]，這可能與遼寧盤錦蟹肉的獨特性有關。呋喃類化合物是糖的分解和美拉德反應的產(chǎn)物，如檢測到的2-戊基呋喃具有可可豆風味，有報道稱該物質(zhì)對蝦蟹肉的風味有負面影響。酚類化合物是芳烴的含羥基衍生物，賦予食品特殊香味，對于食品風味的形成十分重要[26]，本次試驗在雌雄蟹肉中均檢測到2,4-二叔丁基苯酚。另外，在湖北洪湖和遼寧盤錦2個地區(qū)的雄蟹肌肉中檢測到丁酸酐，含量分別為3.50，6.52 ng/g，而在其他2個地區(qū)并未檢測到。

2.2.3 4個地區(qū)蟹肉風味活性物質(zhì)分析

表3 4個地區(qū)雄蟹肌肉主要風味活性物質(zhì)Table 3 The major volatile odor-active compounds in male crab meat from four regions

注：“-”表示未檢索到相關報道。

表4 四個地區(qū)雌蟹肌肉主要風味活性物質(zhì)Table 4 The major volatile odor-active compounds in female crab meat from four regions

續(xù) 表

注：“-”表示未檢索到相關報道。

揮發(fā)性物質(zhì)對食品香氣的貢獻程度不僅僅取決于其濃度大小，還必須考慮閾值的影響，通常認為人能感受到某種揮發(fā)性物質(zhì)的最小濃度為閾值(threshold)，當濃度一定時，化合物閾值越低越容易被感知[27]。因此，對各揮發(fā)性物質(zhì)的“感受強度”可通過該物質(zhì)的絕對濃度除以嗅覺閾值得到，該比值即為氣味活度值(odor activity value，OVA)，以此進一步闡明這些化合物對食品香氣的貢獻度。

由表3和表4可知，4個地區(qū)雄蟹和雌蟹蟹肉中均鑒別出15種對各自風味有貢獻的風味活性物質(zhì)，其中11種是雌蟹和雄蟹蟹肉共同呈現(xiàn)的風味活性物質(zhì)。醛類和酮類由于其含量高和相對較低的閾值，是蟹肉風味的主要貢獻物。安徽當涂雄蟹和雌蟹蟹肉的OAV總和分別為467.30和892.54，均高于其他地區(qū)。進一步分析可知，安徽當涂蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為1-辛烯-3-酮和壬醛；江蘇泗洪蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為壬醛和癸醛；湖北洪湖蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為壬醛和癸醛；遼寧盤錦雄蟹蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為壬醛和癸醛，雌蟹蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為β-紫羅蘭酮和癸醛。

3 結論

我國4個地區(qū)中華絨螯蟹蟹肉電子鼻數(shù)據(jù)PCA分析圖結果表明，4個地區(qū)雌雄蟹肉的氣味區(qū)分度較好，差異明顯，且數(shù)據(jù)分布也存在一定規(guī)律性，其中安徽當涂蟹肉的香氣較為特殊，與其他3個地區(qū)的數(shù)據(jù)點距離較遠。醛類和酮類是蟹肉風味的主要貢獻物，安徽當涂雄蟹和雌蟹蟹肉的OAV總和均高于其他地區(qū)。此外，安徽當涂蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為1-辛烯-3-酮和壬醛；江蘇泗洪和湖北洪湖蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為壬醛和癸醛；遼寧盤錦雄蟹蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為壬醛和癸醛，雌蟹蟹肉的關鍵風味物質(zhì)為β-紫羅蘭酮和癸醛。