李 杰，張星星，郭 晶，張國武，王曉婷，李 妍，才學鵬，孟慶玲 ，喬 軍*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003；2.新疆農墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 石河子 832000；3.中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)所引起豬的一種烈性傳染病[1]。該病毒可感染所有品種和年齡的家豬和野豬，病死率高達80 %～100 %[2]。該病在我國被列為一類動物疫病。ASF最初主要在非洲流行，近年來逐漸擴散到地中海以及東歐等國家或地區(qū)[3-4]，特別是2017年俄羅斯遠東地區(qū)發(fā)生ASF疫情，使得ASF疫病傳入亞洲等國家的風險不斷增大[5]。目前，我國雖未發(fā)生該病，但該病輸入性風險極大。【前人研究進展】在臨床上，ASF主要以高熱和內臟器官出血為主要特征，與豬瘟(CSF)非常相似，因此無法通過臨床癥狀和病理變化進行鑒別診斷，只有依賴于實驗室進行確診[2,4]。目前，ASF的實驗室診斷包括動物接種、病毒分離、病毒核酸DNA 檢測和特異性抗體檢測等方法[6-8]。然而，動物接種、病毒分離和病毒核酸DNA 等檢測方法或需要在生物安全三級以上的實驗室，或需要專業(yè)的儀器設備和技術人員，或操作繁瑣，難以滿足基層檢疫部門的需要[6-7,9]。目前，血清學檢測是診斷和監(jiān)測豬感染ASFV的重要方法之一[9-10]。然而，現(xiàn)有的血清學診斷用抗原多細胞培養(yǎng)的ASFV全病毒抗原，這種抗原雖然敏感性較高，但培養(yǎng)活病毒會存在生物安全方面的隱患[11-12]。近年來，隨著ASFV全基因組測序的完成，國外學者歷史基因工程技術表達了ASFV重要的結構蛋白(如P30、P54、P72和P14.5等)，并利用表達的重組蛋白用于ASFV血清學診斷用抗原的研發(fā)[9-13]。研究發(fā)現(xiàn)，單一重組蛋白抗原雖具有較高的特異性，但敏感性不高。因此，研發(fā)特異性高和反應原性強的ASFV抗原對于高特異性和敏感性血清學診斷方法的建立至關重要?！颈狙芯壳腥朦c】在前期構建ASFV P30-54融合基因基礎上，本研究將P30-54融合蛋白基因克隆入桿狀病毒轉座載體質粒pFastBac1中，在桿狀病毒表達系統(tǒng)中進行表達，分析了重組蛋白的反應原性?！緮M解決的關鍵問題】為特異性高和反應原性強的ASFV診斷用抗原的研發(fā)奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株、培養(yǎng)基及試劑

pT-P30-54重組質粒(含有P30-54融合基因)由本實驗室構建；桿狀病毒表達系統(tǒng)轉移載體pFastBacl、DH10Bac宿主菌、昆蟲細胞Sf9購自Invitrogen公司。IPTG、X-gal、限制性核酸內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、基因組DNA提取試劑盒購自TaKaRa生物公司；昆蟲細胞培養(yǎng)基、水解乳蛋白購自GIBCO公司。小鼠抗ASFV P30-54融合蛋白多克隆抗體由本實驗室制備。HRP標記的兔抗鼠酶標二抗、FITC標記的兔抗鼠IgG熒光抗體購自Sigma公司。

1.2 引物設計與合成

根據(jù) P30-P54融合基因序列設計擴增P30-P54融合基因上游引物FP：5′-GGAATTCATGGATTTTATTTTAAATATATCC-3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)，下游引物RP：5′-CCTCGAGTTACAAGGAGTTTTCCAGGTCTTT-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)，由北京華大基因公司合成。

1.3 重組轉移載體pFast-P30-P54的構建與鑒定

以pT-P30-54重組載體為模板，用引物FP和RP 擴增P30-P54融合基因。PCR的反應體系為：H2O 9 μl，PCR Mixture 8 μl，上下游引物各0.5 μl，DNA模板2 μl。反應條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段用DNA回收試劑盒回。將pFastBac1用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收線性化的pFastBac1載體大片段，將P30-P54融合基因與載體片段用T4 DNA連接酶連接并轉化JM109。 挑取單菌落，提取質粒利用PCR和酶切進行鑒定，獲得重組質粒pFast-P30-P54。

1.4 重組質粒Bacmid-P30-54的篩選和鑒定

將pFastBac1-P30-54轉化含有Bacmid的大腸桿菌DH10Bac，取稀釋液100 μl涂布于含有IPTG/X-gal、卡那霉素(50 μg/mL)、慶大霉素(7 μg/mL)和四環(huán)素(10 μg/mL)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取重組的白色菌落37 ℃培養(yǎng)24 h，進行表型鑒定，按照Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)操作步驟提取重組Bacmid-G基因組，用P30-54基因特異性引物進行PCR鑒定。

1.5 重組病毒reAcMNPV-P30-54的制備及鑒定

用LipofectamineTM將重組Bacmid-P30-54轉染6孔培養(yǎng)板上Sf9昆蟲細胞。將細胞盲傳3代后收集病變細胞培養(yǎng)物，反復凍融3次后，離心取上清得到重組病毒reAcMNPV-P30-54。提取接毒細胞基因組DNA，以其為模板，以P30-54融合基因特異性引物進行PCR，分析目的基因是否插入到重組病毒基因組中。

1.6 重組融合蛋白P30-54的間接免疫熒光(IFA)的檢測

將1×105個細胞在96孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，用reAcMNPV-P30-54接種細胞，以AcMNPV接毒細胞和正常sf9細胞作對照。在接毒72 h以后，用80 %的丙酮固定細胞，0.1 % PBST洗滌3次后，用10 %犢牛血清封閉，250 μl/孔，37 ℃孵育 1 h。洗滌3次后，加入1∶100稀釋的小鼠鼠抗ASFV陽性血清和陰性血清(對照)，100 μl/孔。37 ℃作用1 h，洗滌后加入1∶50稀釋的FITC標記的兔抗鼠熒光二抗，37 ℃孵育 1 h，洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 重組融合蛋白P30-54的SDS-PAGE和Western blot分析

將5×105個細胞傳至24孔板，以reAcMNPV-P30-54接種細胞為試驗組，用AcMNPV接毒細胞和正常sf9細胞作對照。在感染后72 h收集病變細胞，用0.01 mol/L pH 7.2 PBS洗滌3次，-20 ℃和37 ℃反復凍融3次，凍融，用離心后的上清進行SDS-PAGE和Western blot檢測，分析重組融合蛋白P30-54的反應原性。

M. DNA marker (DL-15000+2000); 1. pFast-P30-54 的 EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切; 2. pFast-P30-54 的 EcoRⅠ酶切圖1 重組載體pFast-P30-54的酶切鑒定Fig.1 Identification of pFast-P30-54 by enzyme digestion

2 結果與分析

2.1 重組載體pFast-P30-54的構建及鑒定

重組載體pFast-P30-54 雙酶切可得到1140 bp的目的基因片段和4775 bp的載體大片段(圖1)。PCR擴增得到了與預計大小相符的DNA條帶。結果表明，成功構建了P30-54目的基因的重組轉座載體pFast-P30-54。

2.2 重組載體Bacmid-P30-54陽性克隆的篩選及鑒定

重組載體pFast-P30-54轉化DH10Bac宿主菌后，將轉化后的細菌涂布于含有IPTG/X-gal的抗性平板上進行了3輪表型鑒定，在平板上可出現(xiàn)白色菌落和藍色菌落(圖2，見封三)。挑取陽性克隆(白色菌落)，用P30-54特異性引物擴增，可以獲得與預期大小一致的1140 bp的目的基因片段(圖3)。

2.3 細胞轉染與重組病毒的制備

將重組質粒Bacmid-P30-54分別轉染Sf9昆蟲細胞72 h后，細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變(CPE)，主要表現(xiàn)為變大、變圓、脫落等。收集病變細胞，反復凍融3次，離心取上清即得到重組病毒reAcMNPV-P30-54。提取重組病毒基因組，用P30-54特異性引物進行PCR擴增，結果可得到與預期一致擴增產物(圖4)，表明成功得到了重組病毒。

M. DNA marker (DL-2000);1～2:重組質粒Bacmid-P30-54的PCR擴增圖3 重組載體Bacmid-P30-54的PCR鑒定Fig.3 Identification of Bacmid-P30-54 by PCR amplification

M:DNA marker (DL15000+2000); 1～2:重組病毒reAcMNPV-P30-54的PCR鑒定圖4 重組病毒reAcMNPV-P30-54的PCR鑒定Fig.4 Identification of recombinant reAcMNPV-P30-54 by PCR

2.4 重組融合蛋白P30-54的間接免疫熒光(IFA)檢測

重組Bacmid-P30-54分別轉染昆蟲細胞Sf9后，用含有目的基因的重組病毒reAcMNPV-P30-54的sf9細胞進行IFA實驗，結果發(fā)現(xiàn)感染重組病毒reAcMNPV-P30-54的sf9細胞發(fā)出黃綠色的熒光，而非重組病毒AcMNPV感染細胞無熒光(圖5，見封三)。

2.5 重組融合蛋白P30-54的SDS-PAGE與反應原性分析鑒定

SDS-PAGE檢測結果證實，ASFV P30-54融合基因在桿狀病毒表達系統(tǒng)中進行了表達，分子量為42.5 kDa，與預期大小相符；接種非重組病毒AcMNPV的sf9細胞中無目的蛋白條帶出現(xiàn)。Westernblot分析結果表明，重組融合蛋白P30-54能與小鼠抗ASFV P30-54多克隆抗體發(fā)生特異性免疫學反應(圖6)。

M：標準蛋白marker；1：接種reAcMNPV-P30-54的sf9細胞；2：接種非重組病毒AcMNPV的sf9細胞；W：Western blot 分析圖6 重組融合蛋白P30-54的SDS-PAGE和Western blot分析結果Fig.6 Analysis of recombinant fusion P30-54 protein by SDS-PAGE and Western blot

3 討 論

ASFV屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfarvirus)的成員[3,15]，該病毒只有1 個血清型，但不同地域ASFV分離株基因組存在著明顯的遺傳多樣性[16]。根據(jù)P72 基因遺傳進化分析，目前可將ASFV 至少分為23 個基因型[16,19]。ASFV基因組長度在170～190 kb 之間，可編碼150～200個病毒蛋白[3]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，在ASFV結構蛋白中，P72、P54、P22、P12、P17、P30、P14.5、P150、P37及P34 等蛋白具有較強的抗原性[3,15.20]。

昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)具有真核生物蛋白質翻譯后修飾所必需的酶系統(tǒng)，能有效進行蛋白質的翻譯后加工(糖基化、磷酸化或脂?；?，表達蛋白的空間結構及抗原性與天然蛋白十分相似，是一種常用的真核基因表達系統(tǒng)。目前，該系統(tǒng)已成功表達了禽流感病毒(AIV)、傳染性雞支氣管炎病毒(IBV)、藍舌病病毒(BTV)、雞法氏囊病病毒(IBDV)等多種動物病毒的抗原蛋白。Oviedo等(1997)利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達了ASFV P30和P54蛋白，并且通過間接ELISA評價了兩種重組蛋白用于檢測ASFV抗體的效力[11]。結果表明，p54重組蛋白表現(xiàn)出更強的反應原性，但p30蛋白具有更高的敏感性。研究結果提示，將2種蛋白組合是研發(fā)ASFV特異性強。敏感性高的血清學診斷抗原的重要手段。Barderas等(2001)利用昆蟲細胞和粉紋夜蛾(Trichoplusiani)幼蟲細胞表達了ASFV p54/30嵌合蛋白，將重組蛋白免疫豬后可誘導機體產生對強毒具有中和活性的高水平抗體，提示該嵌合蛋白具有良好的免疫原性[17]。Giménez-Lirola 等(2016)通過大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了ASFV P30和P54和P72蛋白基因[12]，利用熒光微珠免疫試驗評估了純化的 P30和P54和P72重組蛋白對人工感染ASFV血清的檢測能力，結果表明3種蛋白中P30重組蛋白表現(xiàn)出更高的敏感性和特異性；基于P30重組蛋白的間接ELISA可以檢測出人工感染8～12 d的豬血清中ASFV特異性抗體，同時還可用于ASFV感染豬口腔分泌液中抗體的檢測。研究結果證實，ASFV 重組蛋白P30具有作為ASFV診斷抗原研發(fā)的潛力。曹琛福等(2016)利用成功構建了含ASFV p54基因的重組桿狀病毒，并在昆蟲細胞中高效表達，通過免疫印跡試驗和間接ELISA試驗證實其具有良好的反應原性；同時，利用原核表達的ASFVP54蛋白建立了檢測ASFV抗體的競爭ELISA方法，通過對血清樣品的檢測證實其具有較好的特異性和敏感性[21]。

為了研發(fā)特異性強、敏感性高的ASFV血清學診斷用抗原，本研究采用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達了ASFV P30-54融合蛋白基因。通過IFA和Western blot證實ASFV P30-54重組融合蛋白在昆蟲 sf9細胞的胞內表達，且重組蛋白具有較強的反應原性，為特異性高和敏感性強的ASFV診斷方法的建立提供了一個有潛力的候選診斷用抗原。