王耀，曹金博，陳曦，李燕虹，陳秀金，李兆周，鄧瑞廣，胡驍飛*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽(yáng)，471023) 2(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州，450002)

“瘦肉精”是指能夠促進(jìn)肌肉發(fā)育和脂肪分解，提高胴體瘦肉比率的一類(lèi)藥物的俗稱(chēng)，屬于腎上腺素受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物[1]。傳統(tǒng)的“瘦肉精”藥物包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等，臨床上主要用于治療支氣管疾病[2]。該藥物大量使用可促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)脂肪代謝，提高合成速率，增加瘦肉率，因此常被非法用作獸藥和添加在飼料中，但長(zhǎng)期食用“瘦肉精”類(lèi)藥物殘留的動(dòng)物性食品會(huì)引起心悸、頭暈、乏力等中毒癥狀[3]。因此，農(nóng)業(yè)部于2010年12月27日發(fā)布的[1519]號(hào)公告明確指出，禁止在飼料和動(dòng)物飲水中添加以上物質(zhì)。但從2010年開(kāi)始，農(nóng)業(yè)部以及多個(gè)省市在飼料安全預(yù)警監(jiān)測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)存在非法添加使用“新型瘦肉精”的情況，如苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂(lè)定等藥物[4]，不法分子為逃避監(jiān)控，利用其同樣具有腎上腺素受體激動(dòng)劑效應(yīng)，來(lái)降低養(yǎng)殖成本，提高禽畜瘦肉率。因此，動(dòng)物性食品中“新型瘦肉精”殘留的快速監(jiān)控尤為必要，該類(lèi)藥物的快速檢測(cè)方法研究已成為必然趨勢(shì)并且逐漸成為動(dòng)物性食品安全研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。免疫分析技術(shù)以抗原抗體間的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，利用分子標(biāo)記物(如放射性同位素、熒光素、酶、納米發(fā)光材料)作為抗原或抗體的示蹤物，并借助相應(yīng)儀器檢測(cè)，從而顯著提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，是快速檢測(cè)方法的主要技術(shù)支撐[5]。本文對(duì)免疫分析技術(shù)在“新型瘦肉精”殘留檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對(duì)其發(fā)展方向進(jìn)行展望，旨在為建立簡(jiǎn)單快速、靈敏特異的“新型瘦肉精”檢測(cè)方法提供參考。

1 “新型瘦肉精”概述

“新型瘦肉精”主要相對(duì)于鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等在畜禽屠宰過(guò)程中主要監(jiān)控的“傳統(tǒng)瘦肉精”而言，具體包括苯乙醇胺A、賽庚啶、可樂(lè)定、巴氯芬等藥物。苯乙醇胺A(phenylethanolamine A)臨床上用來(lái)治療哮喘等呼吸道疾病，能有效地緩解支氣管痙攣，舒張支氣管等作用[6]。賽庚啶(cyproheptadine)屬于三環(huán)類(lèi)抗組胺藥物，具有顯著的中樞神經(jīng)抑制以及抗膽堿作用，臨床上可用于治療濕疹、蕁麻疹、皮膚瘙癢等皮膚黏膜的過(guò)敏性疾病，也可治療小兒喘息性支氣管炎、瘧疾小兒偏頭痛等[7]。可樂(lè)定(clonidine)能抑制中樞神經(jīng)，臨床上主要用于治療高血壓、高血壓急癥、偏頭痛等癥狀[8]。巴氯芬(baclofen)在臨床上則主要用于治療骨骼肌松馳，緩解痙攣及外傷等[9]。

圖1 主要新型瘦肉精結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of main new types of lean meat powder

雖然幾種“新型瘦肉精”藥物的結(jié)構(gòu)并不相似(如圖1所示)，但卻均具有腎上腺素受體激動(dòng)劑效應(yīng)，能夠起到營(yíng)養(yǎng)再分配作用，降低飼料消耗，提高動(dòng)物生長(zhǎng)速率，改善胴體品質(zhì)。這些藥物也存在一定的毒性作用，如賽庚啶中毒癥狀經(jīng)常表現(xiàn)為嗜睡、共濟(jì)失調(diào)、肌肉抽搐等[10]；可樂(lè)定在體內(nèi)濃度過(guò)高則引起口干、心動(dòng)過(guò)緩、嗜睡等癥狀[11-12]；巴氯芬的不良反應(yīng)則表現(xiàn)為嗜睡、眩暈、抑郁、嘔吐、腹瀉、頭疼等[13]。如果長(zhǎng)期食用含有這些藥物殘留的動(dòng)物性食品，將導(dǎo)致藥物在體內(nèi)蓄積，對(duì)健康產(chǎn)生危害。因此，研發(fā)快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)動(dòng)物性食品中“新型瘦肉精”藥物殘留進(jìn)行高效監(jiān)控就顯得尤為必要。

2 免疫分析技術(shù)

目前，針對(duì)動(dòng)物性食品中“瘦肉精”的確證檢測(cè)方法多以高效液相色譜法[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜法[16-17]為主。色譜技術(shù)選擇性強(qiáng)、分辨率好、靈敏度高、假陽(yáng)性率低，但檢測(cè)過(guò)程比較繁瑣、費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)，儀器要求高，受檢測(cè)地點(diǎn)等因素限制，不能很好地滿(mǎn)足大批量樣品的快速篩查[18]。近年來(lái)，免疫分析技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速，根據(jù)抗原或抗體標(biāo)記物質(zhì)的不同，已形成了放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析、膠體金免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析等方法的分析體系，這些方法利用高親和力抗體對(duì)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別，通過(guò)特定標(biāo)記物質(zhì)作為反應(yīng)放大指示，借助相應(yīng)儀器實(shí)現(xiàn)靈敏特異檢測(cè)。由于免疫分析技術(shù)操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備的要求不高，費(fèi)用低，適用于大批量樣品的快速初步分析[19]。免疫分析技術(shù)已經(jīng)在“傳統(tǒng)瘦肉精”的快速檢測(cè)中成熟應(yīng)用[20]，而針對(duì)“新型瘦肉精”的免疫學(xué)分析技術(shù)較為有限，主要可以分為以下三個(gè)方面。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)是一種經(jīng)典的高靈敏酶免疫分析方法，近年來(lái)，ELISA發(fā)展迅速且技術(shù)逐漸成熟，已經(jīng)成為食品檢測(cè)領(lǐng)域主要的免疫分析方法之一，該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度高，成本較低且不需大型儀器設(shè)備，適合大批量樣品的快速篩查[21]。該方法用于小分子危害物的檢測(cè)時(shí)，多采用間接競(jìng)爭(zhēng)模式，如圖2所示。首先將包被抗原固定于固相載體，檢測(cè)時(shí)將樣品(含游離抗原)和抗體(一抗)混合并與固相載體表面的抗原反應(yīng)，然后洗滌除去游離成分，加入酶標(biāo)二抗與一抗進(jìn)行反應(yīng)，再次洗滌去除游離成分后加入酶反應(yīng)底物引發(fā)顯色反應(yīng)，最后終止反應(yīng)根據(jù)顯色程度進(jìn)行定量或定性分析[22]。

圖2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA原理圖Fig.2 Schematic diagram of indirect competitive ELISA

目前已經(jīng)初步用于一些“新型瘦肉精”藥物的快速檢測(cè)。LI等[23]基于單克隆抗體建立了一種快速檢測(cè)豬肉中苯乙醇胺A的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，半數(shù)抑制濃度(IC50)為6.25 ng/mL，檢測(cè)限為0.19 ng/mL，回收率為103.4%，能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出肉樣中苯乙醇胺A殘留。WANG等[24]開(kāi)發(fā)了一種更為靈敏的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA用于檢測(cè)屠宰后禽畜肉樣中的苯乙醇胺A殘留，該方法IC50為0.32 ng/mL，檢測(cè)限低于0.08 μg/kg，但其回收率范圍較寬，為79.6%～112.6%。黃士新等[25]研發(fā)了一種快速測(cè)定動(dòng)物尿液中賽庚啶殘留的ELISA試劑盒，該試劑盒為間接競(jìng)爭(zhēng)模式，IC50為0.316 μg/L，檢測(cè)限為0.158 μg/L，回收率為80%～110%。李丹妮等[26]同樣基于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA研發(fā)了一種可樂(lè)定ELISA快速檢測(cè)試劑盒，IC50為0.675 ng/mL，檢測(cè)限為0.2 ng/mL，回收率為81%～109%，可用于動(dòng)物尿樣、血清和組織中的可樂(lè)定殘留檢測(cè)。

2.2 膠體金免疫層析試紙

膠體金免疫層析法是膠體金標(biāo)記技術(shù)和抗原抗體的特異性反應(yīng)相結(jié)合的一種免疫檢測(cè)技術(shù)[27]。基于該方法組裝的試紙主要由樣品墊、結(jié)合墊、層析膜(包括檢測(cè)線和質(zhì)控線)、底板、吸水墊組成，結(jié)構(gòu)如圖3所示，用于檢測(cè)小分子物質(zhì)時(shí)，通常采用競(jìng)爭(zhēng)模式[28]，該模式的結(jié)合墊噴點(diǎn)膠體金標(biāo)記的抗體，檢測(cè)限線噴點(diǎn)小分子偶聯(lián)抗原，質(zhì)控線噴點(diǎn)二抗。

圖3 膠體金免疫層析試紙結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Structure diagram of immunochromatographic strip

檢測(cè)時(shí)首先將樣液滴加在樣品墊上或?qū)悠穳|插入樣液，樣液將與金標(biāo)抗體一同向前移動(dòng)，當(dāng)樣品中沒(méi)有抗原時(shí)，檢測(cè)線就會(huì)結(jié)合金標(biāo)抗體而顯色，當(dāng)樣品中存在抗原時(shí)，金標(biāo)抗體就會(huì)先與樣品中抗原結(jié)合，從而使檢測(cè)線結(jié)合的抗體量減少，顯色變?nèi)?，最終通過(guò)顯色強(qiáng)弱間接對(duì)樣品中抗原進(jìn)行定性或定量分析。膠體金免疫層析試紙靈敏度高、對(duì)操作人員要求低，且不需要昂貴的儀器設(shè)備，已用于克倫特羅等傳統(tǒng)瘦肉精的快速檢測(cè)[29]，也是目前動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督部門(mén)對(duì)于“瘦肉精”藥物實(shí)施快速監(jiān)控的主要手段，而且與ELISA相比，可實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)[30]。聶雯瑩等[31]基于競(jìng)爭(zhēng)原理，利用單克隆抗體建立了苯乙醇胺A膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法，試紙檢測(cè)限為5 μg/L， 可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出動(dòng)物尿液中苯乙醇胺A殘留，無(wú)需樣品前處理，且與ELISA測(cè)定結(jié)果沒(méi)有差異。DAI等[32]同樣利用單克隆抗體研制免疫層析試紙用于豬尿中的苯乙醇胺A的檢測(cè)，該試紙?zhí)禺愋愿鼜?qiáng)、靈敏度更高，檢測(cè)限為0.188 ng/mL。而對(duì)于其他“新型瘦肉精”，目前仍未有此類(lèi)方法的研究及試紙產(chǎn)品的生產(chǎn)。

2.3 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器

電化學(xué)發(fā)光免疫傳感檢測(cè)是將免疫技術(shù)和電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種新的標(biāo)記免疫方法。它利用電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑標(biāo)記抗原或抗體，然后與待測(cè)物發(fā)生一系列的免疫反應(yīng)，最后利用免疫反應(yīng)前后電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的改變，對(duì)抗體或抗原進(jìn)行分析。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)單、快速、無(wú)放射污染、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)[33]。與膠體金免疫層析法相比，其表現(xiàn)更加直觀，并可進(jìn)行定量分析，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物分析等領(lǐng)域[34-35]。濟(jì)南大學(xué)張勇等基于金銀納米棒-殼聚糖復(fù)合納米功能材料發(fā)明了一種無(wú)標(biāo)記電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器[36]，用于檢測(cè)動(dòng)物性食品中苯乙醇胺A等多種“瘦肉精”藥物殘留，結(jié)果相對(duì)偏差(RSD)小于3.3%，回收率為93.5%～105%，靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確。湯慶會(huì)[37]則以L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑，在水相中合成CdSe量子點(diǎn)，并利用其構(gòu)建了一種超靈敏的量子點(diǎn)基電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器對(duì)苯乙醇胺A(PA)殘留進(jìn)行了檢測(cè)，原理如圖4所示，該方法檢測(cè)線為0.015 ng/mL，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與苯乙醇胺A濃度在0.05～1 000 ng/mL成線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.997 6， 可定量檢測(cè)樣品中苯乙醇胺A含量。

圖4 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器原理圖Fig.4 Schematic diagram of electroche milumine scence immunosensor

3 小結(jié)

綜上所述，“新型瘦肉精”的出現(xiàn)使動(dòng)物性食品安全出現(xiàn)了新的隱患，其殘留檢測(cè)研究已成為動(dòng)物性食品安全監(jiān)控的重要技術(shù)支撐。在現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)中，靈敏度高、選擇性強(qiáng)的驗(yàn)證檢測(cè)方法已不能滿(mǎn)足實(shí)際現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的需要。相比之下，免疫分析技術(shù)在檢測(cè)效率方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，但目前在“新型瘦肉精”檢測(cè)中應(yīng)用較少，仍有較大的發(fā)展空間?，F(xiàn)有針對(duì)“新型瘦肉精”的免疫檢測(cè)方法主要存在以下3個(gè)方面的問(wèn)題，(1)所檢測(cè)的藥物種類(lèi)偏少，大多數(shù)方法主要針對(duì)苯乙醇胺A進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)于其他“新型瘦肉精”藥物，甚至對(duì)于未被列入國(guó)家禁用藥物名單的受體激動(dòng)劑藥物則缺乏相關(guān)研究；(2)免疫分析方法檢測(cè)效率高，但相對(duì)于其他檢測(cè)方法，容易出現(xiàn)假陰性與假陽(yáng)性結(jié)果，目前僅適用于大量樣品的快速篩查，因此在高特異性抗體制備及定量檢測(cè)方法研究方面仍需加強(qiáng)；(3)對(duì)于方法的研究仍存在一定的局限性，一些在小分子污染物檢測(cè)中已廣泛應(yīng)用的標(biāo)記材料和技術(shù)仍缺乏報(bào)道，以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)熒光偏振免疫檢測(cè)、時(shí)間分辨免疫檢測(cè)、量子點(diǎn)發(fā)光免疫檢測(cè)等高靈敏方法也缺乏研究。因此，隨著動(dòng)物性食品安全監(jiān)控體系的完善，免疫分析技術(shù)的不斷深入研究將為“新型瘦肉精”的快速高效篩查提供多樣化、廣覆蓋的檢測(cè)手段，以滿(mǎn)足不同層次的需求，同時(shí)也將為保障食品安全提供更好的技術(shù)支撐。