阮征，魏力，張延杰，夏雨，李汴生*

1(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510640) 2(廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510640) 3(咀香園健康食品(中山)有限公司，廣東 中山，528400)

根據(jù)GB19855—2015中的定義，冰皮月餅以糯米粉，大米淀粉，玉米淀粉等為餅皮的主要原料，經(jīng)熟制后制成餅皮，包裹餡料，并經(jīng)成型，冷藏(或不冷藏)等冷加工工藝制成的口感綿軟的月餅[1-2]。冰皮月餅相比于傳統(tǒng)月餅，為了保持其本真原料的外觀色澤(例如熟糯米粉制備的月餅外觀潔白如雪，故以“冰皮”命名)，一般不經(jīng)過烤制處理，采用冷加工工藝，要求在潔凈度較高的環(huán)境下加工。然而，即便如此，由于原輔料營養(yǎng)豐富，加工過程缺乏殺滅或抑制微生物生長(zhǎng)的控制措施，導(dǎo)致冰皮月餅，尤其是常溫貯存的產(chǎn)品存在較大的安全隱患，往往需要通過添加抑菌物質(zhì)等手段來提高其保藏性。其中月餅中芽孢桿菌和霉菌對(duì)環(huán)境的耐受力很強(qiáng)，較難控制，對(duì)其原輔料和加工過程的菌群多樣性進(jìn)行分析，才能更有效地進(jìn)行追溯和防控。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究食品腐敗微生物的方法越來越多。高通量測(cè)序作為新一代測(cè)序技術(shù)的代表，所包含信息量大，但是信息的歸類整合模糊，無法區(qū)分死菌與活菌，因此常常需要輔助另外一些手段進(jìn)行研究[3-6]。傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)可培養(yǎng)的條件有限，對(duì)于絕大多數(shù)微生物并不能很好地富集和分離，而且培養(yǎng)周期長(zhǎng)，但成本低、分離出的菌體純度高，在微生物研究中仍有重要地位，可以作為高通量測(cè)序技術(shù)的補(bǔ)充，同時(shí)傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)能更好更準(zhǔn)確地區(qū)分活菌和死菌，因此高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)能更加真實(shí)準(zhǔn)確地反映系統(tǒng)中的活菌情況[7-10]，這樣有助于更準(zhǔn)確地研究系統(tǒng)中的腐敗微生物。曹榮等[9]利用高通量測(cè)序技術(shù)和傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)研究牡蠣微生物群落，發(fā)現(xiàn)2種方法得到的結(jié)果一致。

關(guān)于月餅腐敗菌的研究主要集中在傳統(tǒng)烘焙型月餅的霉菌群系上，黃愷婷[11]對(duì)廣式月餅腐敗霉菌進(jìn)行了分離，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致廣式月餅敗壞的霉菌以曲霉菌和青霉菌為主；陳盼[12]對(duì)廣式月餅中的微生物區(qū)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)微生物群系以細(xì)菌為主，其次是霉菌和酵母菌；顧媛等[13]研究肉制品月餅微生物群系，發(fā)現(xiàn)霉菌主要有灰綠曲霉、雜色曲霉和黃曲霉。目前對(duì)于冰皮月餅腐敗微生物的群系研究鮮有報(bào)道。本研究選擇未添加抑菌物質(zhì)的油沙冰皮月餅(餡料為油性豆沙)為研究對(duì)象，以高通量測(cè)序和傳統(tǒng)培養(yǎng)為手段，研究常溫貯藏樣品的微生物菌群結(jié)構(gòu)和主要來源，在不影響冰皮月餅特征感官品質(zhì)的前提下，探究包裝前短時(shí)間熱處理和紫外線處理對(duì)菌群狀況的影響，以期為常溫冰皮月餅的安全性控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油性豆沙餡料、冰皮月餅預(yù)拌粉、麥芽糖漿、白奶油，市售。

1.2 試驗(yàn)方法

冰皮月餅制作流程：清水與麥芽糖漿混合煮沸；取冰皮預(yù)拌粉與混合液混合慢速攪拌，分2次加入白奶油，攪拌成型；取出面團(tuán)，整形分割；包裹餡料，模具成型；包裝(添加脫氧劑)。

鑒于熱處理和紫外線處理是常用的微生物控制的物理方法，在不影響冰皮月餅固有外觀品質(zhì)的前提下，對(duì)包裝前的樣品進(jìn)行短時(shí)熱處理(170 ℃, 8 min)和紫外處理(250～270 nm, 30 min)，探討2種手段對(duì)常溫冰皮月餅微生物控制的可行性(操作環(huán)境經(jīng)過30 min紫外處理，所有接觸表面經(jīng)過酒精消毒，經(jīng)環(huán)境檢驗(yàn)符合國家標(biāo)準(zhǔn))。

樣品標(biāo)注為對(duì)照樣，紫外線處理，熱烘+紫外線處理。樣品未添加抑菌物質(zhì)，置于25 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測(cè)與方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化及鑒定[14-17]

常溫冰皮月餅腐敗菌分離純化：過程樣及成品于無菌操作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭無菌包裝表面后，共取25 g樣品置入225 mL的無菌生理鹽水中，均質(zhì)5 min，無菌生理鹽水做梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4。從以上稀釋度菌液中各取0.1 mL在選擇性培養(yǎng)基平板上涂布均勻，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基種類如表1所示。然后觀察各平板菌落形態(tài)及分布，挑取典型菌落平板劃線直至出現(xiàn)單一菌落，挑取純菌落于肉湯培養(yǎng)過夜，4 ℃保存?zhèn)溆谩＜兣囵B(yǎng)腐敗菌的生化鑒定：分離純化菌株依據(jù)伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)和真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表1所示。

1.3.2 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)微生物多樣性[18-20]

1.3.2.1 DNA抽提和純度檢測(cè)

在超凈工作臺(tái)稱取25 g成品樣品放入裝有225 mL 生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)5 min，無菌操作取2 mL均質(zhì)液至無菌離心管，放入離心機(jī)3 000 r/min離心1 min，吸取離心管中上清液至2 mL無菌離心管中，放入高速冷凍離心機(jī)，4 ℃，12 000 r/min離心2 min， 棄去上清液，離心沉淀按照細(xì)菌基因組試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA，并利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA純度。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

基因組DNA采用16SrDNA的引物338F_806R(338F，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′，806R，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)對(duì)V3可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性1個(gè)循環(huán)(95 ℃，3 min)， 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(變性95 ℃，30 s；退火60 ℃， 30 s；延伸72 ℃，45 s)，最后72 ℃延伸10 min；PCR反應(yīng)體系為5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer(338F,5 μmol/L) 0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，ddH2O 11.8 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，并進(jìn)行混樣，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度檢測(cè)，使用試劑盒回收PCR產(chǎn)物。由上海美吉生物構(gòu)建PE擴(kuò)增子文庫，并使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 單種純化菌落鑒定方法[21-24]

1.3.3.1 純化菌種DNA提取

取37 ℃肉湯培養(yǎng)的菌液3 mL，12 000 r/min離心1 min，棄去上清液，加入0.5 mL TE懸浮沉淀，并加入75 μL，50 mg/mL溶菌酶溶液，30 ℃保溫10 min， 加入體積分?jǐn)?shù)10% SDS，5 μL蛋白酶K，混勻，37 ℃保溫30 min，加入0.75 mL，5 mol/L NaCl，混勻，用V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1抽提，12 000 r/min離心1 min，將上清液移至干凈離心管，用V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1抽提，靜置10 min， 12 000 r/min離心1 min，轉(zhuǎn)移上清液干凈管，加2倍體積乙醇沉淀DNA，混合，室溫靜置10 min，離心沉淀DNA，70%乙醇漂洗DNA后，用3050 TE溶解DNA備用。

1.3.3.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

基因組DNA采用引物27F_1492R 引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG- 3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為2×Taq Plus Master Mix 10 μL，5p 27F 0.8 μL，5p 1492R 0.8 μL，Template 1.0 μL，ddH2O 7.4 μL；PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性1個(gè)循環(huán)(95 ℃，5 min)，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)(變性95 ℃，30 s；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s)， 最后72 ℃延伸10 min；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),使用試劑盒回收PCR產(chǎn)物并測(cè)序，結(jié)果在NCBI文庫中進(jìn)行比對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分析圖采用Excel 2016，Origin 7進(jìn)行處理；采用SPSS 21.0進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰皮月餅成品菌群的構(gòu)成分析

圖1反應(yīng)的是對(duì)照樣高通量測(cè)序的結(jié)果，該結(jié)果反映從樣品中共分離鑒定出16個(gè)屬，分別為藍(lán)細(xì)菌屬(Cyanobacteria)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)，鏈球菌屬(Streptococcus)，黃單胞菌屬(Xanthomonas)，乳球菌屬(Lactococus)，腸桿菌屬(Enterobacter)，紅球菌屬(Rhodococcus)，氣單胞菌屬(Aeromonas)以及金黃桿菌屬(Chryseobacterium)等。其中微生物屬豐度前3的屬為藍(lán)細(xì)菌屬，葡萄球菌屬和不動(dòng)桿菌屬。對(duì)照樣進(jìn)行傳統(tǒng)分離培養(yǎng)，共分離得到6株菌株，經(jīng)鑒定得到葡萄球菌屬占16.67%，芽孢桿菌屬占50.00%，未知屬占33.33%；結(jié)合高通量測(cè)序，可知樣品中存在的葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬占有較大的比例。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)從對(duì)照樣中分離得到3株霉菌，分別為毛霉，青霉和曲霉；而食品中的腐敗菌主要包括細(xì)菌，酵母和霉菌，其中細(xì)菌主要包括芽孢桿菌屬，假單胞菌屬，葡萄球菌屬和黃桿菌屬等，這些微生物屬對(duì)于蛋白質(zhì)類食品，碳水化合物類食品和脂肪類食品表現(xiàn)為不同的分解能力，但是作為腐敗菌總體皆表現(xiàn)為對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和感官的破壞。結(jié)果表明，本研究中冰皮月餅的主要腐敗細(xì)菌為芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。

圖1 樣品微生物屬的相對(duì)豐度Fig.1 The relative abundance of different samples

2.2 短時(shí)熱烘結(jié)合紫外線處理對(duì)冰皮月餅菌群結(jié)構(gòu)的影響

圖2反映的是經(jīng)過短時(shí)熱處理和紫外處理的成品樣品高通量測(cè)序的結(jié)果，該結(jié)果反映從樣品中共分離鑒定出14個(gè)屬，結(jié)果同對(duì)照樣的菌群結(jié)構(gòu)相似，表明短時(shí)熱處理和紫外處理對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響不大；其中經(jīng)過短時(shí)熱處理和紫外處理的成品樣品中微生物屬豐度前三的屬為藍(lán)細(xì)菌屬，相對(duì)豐度分別為29.89%，39.79%；芽孢桿菌屬，相對(duì)豐度分別為20.62%，19.38%； 葡萄球菌屬，相對(duì)豐度分別為11.70%，9.58%；結(jié)果與對(duì)照樣有差異，說明短時(shí)熱處理和紫外線處理雖然對(duì)菌群結(jié)構(gòu)組成影響不大，但是能夠影響不同菌群之間的相對(duì)豐度。同樣傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)從經(jīng)過短時(shí)熱處理和紫外處理的成品樣品中分離得到3株霉菌，分別為毛霉，青霉和曲霉，說明短時(shí)熱處理和紫外處理對(duì)于霉菌的種類影響不大。

圖2 樣品微生物屬的相對(duì)豐度Fig.2 The relative abundance of different samples

2.3 冰皮月餅常溫貯藏過程微生物數(shù)量的變化

圖3反映的是樣品貯藏過程中微生物數(shù)量的變化情況。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果和傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)得出，實(shí)驗(yàn)用冰皮月餅主要存在的腐敗菌為葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬，因此探究腐敗菌屬葡萄球菌和芽孢桿菌在貯藏過程中的變化對(duì)于了解和控制腐敗菌的生長(zhǎng)有利。(1)反映隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)樣品中菌落總數(shù)、芽孢桿菌和霉菌呈現(xiàn)顯著性增長(zhǎng)(P<0.05)，而葡萄球菌屬的數(shù)量呈現(xiàn)顯著性降低的趨勢(shì)(P<0.05)；(2)反映了微生物的變化隨貯藏時(shí)間變化的關(guān)系，同樣得出與(1)一樣的變化趨勢(shì)；經(jīng)過短時(shí)間的熱處理和紫外處理，樣品中的菌落總數(shù)增加，而葡萄球菌數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但是短時(shí)間的熱處理對(duì)于霉菌和芽孢桿菌的影響較小。未經(jīng)過熱處理的樣品在貯藏30 d時(shí)，菌落總數(shù)達(dá)到1 280 CFU/g，超過標(biāo)準(zhǔn)(≤1 000 CFU/g)的1.2倍，而經(jīng)過短時(shí)間熱處理的樣品在40 d后微生物才超標(biāo)(1 039 CFU/g)，表明短時(shí)熱處理對(duì)微生物的生長(zhǎng)有抑制作用。通過前面的分析，樣品中主要存在的腐敗微生物芽孢桿菌屬有較強(qiáng)的抗逆性，在貯藏過程中呈現(xiàn)顯著性增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此采取有效的措施從原料入手，才能減少樣品中的微生物污染。

a-紫外線處理；b-熱烘+紫外線處理圖3 樣品貯藏過程中微生物變化Fig.3 Microbial changes of samples during storage

2.4 冰皮月餅常溫貯藏過程水分活度的變化

貯藏過程中，冰皮月餅皮料和餡料水分活度的變化如圖4所示。

a-皮料水分活度；b-餡料水分活度圖4 樣品貯藏期間水分活度變化Fig.4 Changes in water activity during storage of samples

其中在貯藏過程中，皮料水分活度呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)，而餡料水分活度變化不顯著。食品貯藏穩(wěn)定性與水分活度存在一定關(guān)系，其中對(duì)于微生物來說，大部分細(xì)菌在水分活度低于0.90時(shí)無法繁殖，大部分霉菌可在0.80～0.87生長(zhǎng)；且樣品的皮料的水分活度分別從0.836下降到0.756(P<0.05)，從0.833到0.762 (P<0.05)，說明實(shí)驗(yàn)樣品在貯藏過程中水分活度呈現(xiàn)顯著性降低的趨勢(shì)，大部分微生物的生長(zhǎng)受到抑制。

2.5 腐敗微生物溯源分析

表2反映的是微生物生理生化鑒定結(jié)果與NCBI文庫序列比對(duì)結(jié)果。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)從原料，過程樣和成品共分離得到55株細(xì)菌和6株霉菌(其中毛霉占33.33%，青霉占16.67%，曲霉占50.00%)；經(jīng)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)和生理生化鑒定，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)比例較高，分別為58.18%，12.72%；依據(jù)初步鑒定結(jié)果劃分為 11株不同細(xì)菌，其中從原料到成品都存在的微生物包含4株，分別為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ。

表2 NCBI序列對(duì)比結(jié)果Table 2 NCBI sequence comparison results

其中Ⅰ，Ⅲ及毛霉分離來源于冰皮月餅預(yù)拌粉；Ⅱ，Ⅳ，青霉和曲霉分離來源于餡料。根據(jù)伯氏細(xì)菌手冊(cè)鑒定Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，黃單胞菌屬(Xanthomonas)，芽孢桿菌屬(Bacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，且分離得到的這些微生物是樣品中的有害微生物?？紤]到傳統(tǒng)生理生化鑒定存在一定的局限性，對(duì)純化的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ菌株進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，通過基因提取，PCR擴(kuò)增，其結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，如表2所示，發(fā)現(xiàn)在NCBI文庫中，Ⅰ鑒定屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，Ⅱ鑒定屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)，Ⅲ鑒定屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，Ⅳ鑒定屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，且與NCBI其他已知微生物基因序列相似性達(dá)到99%，此結(jié)果與傳統(tǒng)純培養(yǎng)和高通量測(cè)序結(jié)果相似，發(fā)現(xiàn)從樣品中存在的腐敗微生物主要為芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，且一直存在于整個(gè)加工過程中的腐敗細(xì)菌為芽孢桿菌屬，寡樣單胞菌屬和類芽孢桿菌屬，并主要來自于原料粉料和餡料，所以原料中原有的微生物是導(dǎo)致樣品微生物污染的主要來源。

3 結(jié)論

本文采用高通量測(cè)序和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法分析了常溫油沙冰皮月餅的微生物菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。

從研究結(jié)果上看，在屬的水平上，經(jīng)過短時(shí)熱處理和紫外處理的油沙冰皮月餅菌群中豐度前三位的菌屬為藍(lán)細(xì)菌屬(Cyanobacteria)，芽孢桿菌屬(Bacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)，且芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬是其主要腐敗有害微生物，而藍(lán)細(xì)菌屬對(duì)樣品腐敗幾乎沒有影響；且經(jīng)過不同處理，盡管菌群結(jié)構(gòu)相似，但不同種屬之間相對(duì)豐度有差異，兩種處理方式能降低樣品中的微生物數(shù)量。結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，分析成品中微生物的來源發(fā)現(xiàn)，分離得到的微生物主要來源于各種原料，其中含量較多的芽孢桿菌屬主要來源于粉料，霉菌主要來源于粉料和餡料；隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其中樣品的菌落總數(shù)，芽孢桿菌和霉菌呈現(xiàn)顯著性增加的趨勢(shì)，而葡萄球菌呈現(xiàn)顯著性降低的趨勢(shì)，因?yàn)殡S著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的水分活度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，對(duì)于抗逆性較強(qiáng)的霉菌和芽孢桿菌，更加能適應(yīng)較惡劣的環(huán)境。

包裝前短時(shí)間熱處理和紫外線處理對(duì)于冰皮月餅中的微生物有一定的影響，但是處理強(qiáng)度過高會(huì)影響冰皮月餅的特有感官品質(zhì)，因此僅僅依靠強(qiáng)度有限的熱烘和紫外處理難以達(dá)到常溫貯存所需的殺菌或抑菌程度。一方面，鑒于芽孢桿菌、霉菌等主要污染微生物大多屬于好氧微生物，在月餅包裝袋中添加脫氧劑可以提供一種有效的保藏途徑；另一方面，有針對(duì)性地控制冰皮月餅的初始微生物污染程度將有助于貯存期的延長(zhǎng)。結(jié)果顯示原輔料是常溫冰皮月餅的主要微生物污染源，因此皮料餡料等的衛(wèi)生安全水平將直接影響終產(chǎn)品的安全性和貯存期。