王福琴

（山西醫(yī)科大學(xué)晉祠學(xué)院，山西太原 030025）

目前，肺癌發(fā)病機(jī)制仍未明確，臨床多經(jīng)手術(shù)、放化療治療，但術(shù)后癌細(xì)胞侵襲性轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)仍是影響肺癌患者死亡的重要原因[1]。因此，探尋肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要。而包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有較大關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中BMP-2特異性升高，可判斷預(yù)后[2]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族成員，可刺激骨細(xì)胞分化。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）為BMPs最具代表性因子，可促進(jìn)骨修復(fù)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。但臨床就其BMP-2對(duì)肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響的研究仍較少。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，取自12例手術(shù)切除肺腺癌組織新鮮標(biāo)本，其中男8例、女4例；年齡41～75（60.05±1.55）歲。儀器包括美國(guó)Beckman公司高速低溫離心機(jī)、美國(guó)Forma Scientific公司細(xì)胞培養(yǎng)箱、日立公司7000型自動(dòng)生化分析儀、美國(guó)BD公司Matrigel侵襲小室24孔培養(yǎng)板等。試劑包括Bioscience公司流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒、美國(guó)R&D公司BMP-2（質(zhì)量濃度1 mg/mL）、美國(guó)Cell Signaling公司鼠抗人E-cad單克隆抗體、美國(guó)Invitrogen公司DMEM高糖培養(yǎng)液、鏈霉素、青霉素等。

1.2 方法

1.2.1 BMP-2對(duì)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、凋亡影響檢測(cè)

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組

人肺腺癌A549細(xì)胞以青霉素、10%胎牛血清、鏈霉素制成的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)良好。隨機(jī)分為A組（空白對(duì)照）、B組（10 μg/mL BMP-2處理24 h）、C組（50 μg/mL BMP-2處理24 h）、D組（100μg/mL BMP-2處理24 h），各3例。

1.2.1.2 細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

經(jīng)免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)E-cad表達(dá)：SP法行E-cad蛋白染色，加入一抗，4 ℃下孵育，過(guò)夜；PBS液洗滌，3次；加入二抗，37 ℃下孵育，30 min；DAB顯色，10 min；染色、脫水、透明，中性樹(shù)膠封固。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒著色。400倍光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)E-cad表達(dá)強(qiáng)度，每個(gè)點(diǎn)陣計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞。陽(yáng)性（++）為E-cad陽(yáng)性細(xì)胞≥90%，弱陽(yáng)性（+）為10%～90%，陰性（-）為＜10%或完全消失。

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)：200 μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，100 ℃下煮沸，5 min，混合蛋白加樣緩沖液，10% SDS-PAGE分離蛋白。室溫下封閉2 h，加入一抗、vimentin、BMP-2、β-actin單克隆抗體，4 ℃下過(guò)夜。緩沖液洗膜，3次，加入二抗，室溫孵育，1 h。緩沖液洗膜，3次，加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，室溫孵育，3 min。暗室曝光，30 s～5 min，顯影，定影，成像。目的條帶以IPP軟件行灰度分析。

1.2.1.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

B、C、D組以胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心，置于無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞密度5×105/個(gè)。24孔培養(yǎng)板中置入Matrigel侵襲小室，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液500 μL加入下室，以細(xì)胞懸液200 μL加入上室，培養(yǎng)24 h。PBS液洗滌，3次；37 ℃下，以4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，30 min；PBS液洗滌，3次；小室內(nèi)面Matrigel基質(zhì)膠以棉簽清除干凈，細(xì)胞核染色，置于載玻片，200倍熒光顯微鏡下觀察。分別取每張膜上、下、左、右、中部視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

6孔培養(yǎng)板內(nèi)，以1×106個(gè)/mL密度接種A549細(xì)胞。B、C、D組各設(shè)置3個(gè)平行孔。作用24 h后，收集細(xì)胞，離心，PBS液洗滌，2次；結(jié)合液重懸蛋白、Annexin V-FITC避光孵育，15 min；離心，沉淀。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.2 BMP-2促進(jìn)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡中p38 MAPK信號(hào)作用

實(shí)驗(yàn)分組：進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中加入100 μg/mL BMP-2處理24 h，設(shè)為E組；E組基礎(chǔ)上再加終質(zhì)量濃度10 μmol/L的sb203580處理細(xì)胞24 h，設(shè)為F組。分別經(jīng)免疫組織化學(xué)法、FCM法等檢測(cè)p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)BMP-2誘導(dǎo)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、凋亡的影響，方法同1.2.1。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)以GraphPad Prism 5軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，以t檢驗(yàn)對(duì)比。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMP-2對(duì)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響

B、C、D組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)E-cad表達(dá)強(qiáng)度呈濃度依賴性降低，見(jiàn)圖1。C組、D組BMP-2表達(dá)水平高于A組（P＜0.05），D組vimentin水平高于A組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 四組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)E-cad表達(dá)強(qiáng)度

表1 四組E-cad、vimentin水平對(duì)比（±s，μg/mL）

表1 四組E-cad、vimentin水平對(duì)比（±s，μg/mL）

組別E-cadvimentin A組0.45±0.050.22±0.02 B組0.38±0.040.23±0.03 C組0.19±0.040.25±0.05 D組0.15±0.030.38±0.05

2.2 BMP-2對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲、凋亡的影響

B、C、D組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)多于A組，細(xì)胞早期凋亡率低于A組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 四組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)、早期凋亡率對(duì)比（±s）

表2 四組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)、早期凋亡率對(duì)比（±s）

組別穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)/個(gè)細(xì)胞早期凋亡率/%A組45.28±18.605.14±2.05 B組114.35±14.681.62±0.55 C組212.48±14.851.31±0.35 D組315.26±30.480.98±0.48

2.3 BMP-2促進(jìn)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中p38 MAPK信號(hào)作用

F組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)E-cad表達(dá)高于E組，如圖2。F組E-cad表達(dá)水平高于E組，vimentin表達(dá)水平低于E組（P＜0.05），如表3。

圖2 兩組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)E-cad表達(dá)強(qiáng)度

表3 兩組E-cad、vimentin水平對(duì)比（±s，μg/mL）

表3 兩組E-cad、vimentin水平對(duì)比（±s，μg/mL）

組別E-cadvimentin E組0.20±0.100.51±0.10 F組0.31±0.110.39±0.08

2.4 BMP-2促進(jìn)A549細(xì)胞侵襲、凋亡中p38 MAPK信號(hào)作用

F組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)少于E組，細(xì)胞早期凋亡率高于E組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 兩組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)、早期凋亡率對(duì)比（±s）

表4 兩組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)、早期凋亡率對(duì)比（±s）

組別穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)/個(gè)細(xì)胞早期凋亡率/%E組305.48±45.600.89±0.45 F組155.65±23.051.54±0.78

3 討論

目前認(rèn)為，肺癌形成是一個(gè)多因素、多步驟過(guò)程，具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，誘發(fā)機(jī)體死亡重要原因之一為腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[3]。BMP信號(hào)通路與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，抑制BMP受體表達(dá)可阻斷BMP信號(hào)通路，控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)分化[4]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化即特定生理、病理狀況下上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，可致使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力“間質(zhì)樣”細(xì)胞，且可侵入周?chē)M織間隙、脈管系統(tǒng)，引發(fā)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。而肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化由多種細(xì)胞因子參與，如BMP-2等。BMP-2能參與調(diào)控多種基因生理活性，可引發(fā)細(xì)胞增殖、凋亡，且在組織修復(fù)、再生中作用顯著。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中存在BMP-2高表達(dá)，且參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展[5]。但臨床就肺癌細(xì)胞中BMP-2表達(dá)的研究仍較少。

機(jī)體正常上皮細(xì)胞完整性維持中，E-cad蛋白意義顯著，該蛋白屬于上皮細(xì)胞表型特征蛋白，廣泛參與細(xì)胞間連接。本研究中，B、C、D組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均存在E-cad表達(dá)，且強(qiáng)度呈濃度依賴性降低。而E-cad表達(dá)下降，可反映上皮細(xì)胞特征的丟失。Vimentin是一種細(xì)胞骨架蛋白，在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)，但可在間質(zhì)細(xì)胞中廣泛存在，如巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要因素。本研究中，隨著B(niǎo)MP-2濃度的提升，肺癌細(xì)胞內(nèi)vimentin呈濃度依賴性增加。提示BMP-2可促使肺癌細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，B、C、D組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)較A組多，且三組呈遞增趨勢(shì)，推測(cè)BMP-2可提升A549細(xì)胞侵襲能力。細(xì)胞凋亡為腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)控一個(gè)重要機(jī)制。但臨床針對(duì)肺癌細(xì)胞出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后是否影響細(xì)胞凋亡能力仍存在較大爭(zhēng)議。本次研究中，B、C、D組細(xì)胞早期凋亡率均較A組低，三組呈遞減趨勢(shì)，分析可能與所選細(xì)胞株本身凋亡率偏低有關(guān)，而B(niǎo)MP-2可抑制A549細(xì)胞早期凋亡，且增強(qiáng)侵襲能力。

本研究還分析了BMP-2促進(jìn)A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中p38 MAPK信號(hào)的作用。p38 MAPK是一種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，且可影響多種腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK特異性抑制劑SB203580能激活caspase-8啟動(dòng)外源性凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。本研究中，F(xiàn)組E-cad表達(dá)水平較E組高，vimentin水平較E組低，提示p38 MAPK通路抑制劑能調(diào)控部分BMP-2誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。F組穿過(guò)濾泡細(xì)胞數(shù)少于E組，早期凋亡率高于E組，故推測(cè)p38 MAPK通路抑制劑能對(duì)BMP-2誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行抑制，并逆轉(zhuǎn)BMP-2誘導(dǎo)A549細(xì)胞早期凋亡。但考慮到肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生與多種復(fù)雜信號(hào)通路有關(guān)，并非由單因素決定，故今后仍需進(jìn)行更深層次分析。

綜上所述，肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生中BMP-2作用顯著，可經(jīng)由激活p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)控，從而促使細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，抑制細(xì)胞凋亡。