趙秋陽，馬賢德

腦梗死屬缺血性腦病之一，又叫做缺血性卒中，中醫(yī)稱為中風(fēng)。近年來的研究表明，炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等均在腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[1-2]。這一研究成果為腦梗死的多靶點(diǎn)治療提供了理論依據(jù)。百會(huì)穴具有醒腦開竅，回陽固脫之功效。四神聰位于百會(huì)前、后、左、右各開1寸處，名為四神聰?！秷D翼》中記載：前神聰主治中風(fēng)、風(fēng)癇……后神聰同。研究顯示，百會(huì)、四神聰配合針刺，對(duì)腦梗死患者認(rèn)知功能障礙具有一定的改善作用[3]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，針刺百會(huì)穴對(duì)線栓法大鼠大腦中動(dòng)脈缺血 (middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠血清細(xì)胞因子具有一定調(diào)控作用，此外該穴位在癲癇等疾病的治療中也具有調(diào)控細(xì)胞因子的作用[4-6]。本研究擬通過線栓法制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，然后給予針刺百會(huì)、四神聰穴干預(yù)，觀察缺血半暗帶腦組織中白細(xì)胞介素1(interleukin-1, IL-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)的含量，探討針刺百會(huì)、四神聰穴對(duì)MCAO模型大鼠的抗炎作用。

1 材料和方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠60只，購自遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001)，體質(zhì)量270～330g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購入后，于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SYXK(遼)2013-0009。以常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12h晝夜節(jié)律，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。②實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備： IL-1、IL-6、TNF-α檢測(cè)試劑盒均由武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)分別為：SEA563Ra、SEA079Ra、SEA133Ra。酶標(biāo)儀，Thermo生產(chǎn)；移液器，Thermo生產(chǎn)；恒溫水浴振蕩器，常州國(guó)華儀器設(shè)備廠生產(chǎn)。

1.2 方法 ①實(shí)驗(yàn)分組：首先將大鼠按照體質(zhì)量進(jìn)行標(biāo)記1～60號(hào)，然后采用隨機(jī)數(shù)字法，將大鼠分為假手術(shù)組(15只)和造模組(45只)。然后采用改良線栓法對(duì)造模組45只大鼠進(jìn)行CIRI模型復(fù)制，評(píng)價(jià)模型成功后，再將成功的動(dòng)物模型隨機(jī)分為2組：非穴區(qū)對(duì)照組和針刺組。最終實(shí)驗(yàn)分為3組：即假手術(shù)組、非穴區(qū)對(duì)照組和針刺組。②模型復(fù)制：造模組大鼠采用線栓法復(fù)制腦缺血再灌注模型，方法參考馬賢德等[7]的文獻(xiàn)，假手術(shù)組大鼠實(shí)施相同術(shù)式，但釣魚線插入深度為1cm，不造成實(shí)質(zhì)性栓塞。③模型評(píng)價(jià)：再灌注后2h，大鼠完全蘇醒后，參考Bederson等[8]的5分制神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為無癥狀；1分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向?qū)?cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分為1～3分者納入實(shí)驗(yàn)組，未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者排除。再灌注2h后，從假手術(shù)組和造模組中各隨機(jī)抽取1只，進(jìn)行TTC染色，觀察梗死灶形成情況，以評(píng)價(jià)模型復(fù)制是否成功。④針刺干預(yù)：模型復(fù)制成功后，假手術(shù)組不做干預(yù)。大鼠取穴參考“大鼠穴位圖譜”及“中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)”確定[9-10]。針刺組大鼠給予百會(huì)、四神聰穴針刺干預(yù)，間隔8小時(shí)一次，至再灌注72h結(jié)束；非穴區(qū)對(duì)照組大鼠分別于百會(huì)、四神聰穴區(qū)周邊5mm處進(jìn)行針刺皮膚干預(yù)，間隔8小時(shí)一次，至再灌注72h結(jié)束。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) ①神經(jīng)功能缺損評(píng)分：末次針刺后1h，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分采用雙盲法，邀請(qǐng)不知情實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員單獨(dú)進(jìn)行評(píng)分，按照各大鼠編號(hào)記錄評(píng)分。②病理(蘇木素-伊紅染色)：末次針刺后1h，各組隨機(jī)抽取2只大鼠，采用過量麻醉法處死，迅速于冰面上取出完整大腦組織，并迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24h以上，常規(guī)制備石蠟切片，并行蘇木素-伊紅染色，數(shù)碼顯微鏡下觀察病理改變，拍攝照片。③缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量測(cè)定：末次針刺后1h，各組剩余大鼠，采用過量麻醉法處死，迅速于冰面上取出完整大腦組織，并用眼科鑷去除缺血區(qū)域液化壞死的腦組織，沿缺血灶走行，剝離缺血灶周邊2mm區(qū)域內(nèi)半暗帶組織，置于2ml凍存管中，-80℃保存，用于檢測(cè)IL-1、IL-6、TNF-α含量測(cè)定。假手術(shù)組取相應(yīng)部位腦組織進(jìn)行檢測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)價(jià)

2.1.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 模型復(fù)制后，手術(shù)意外及栓塞過重死亡共計(jì)4例，假手術(shù)組剩余15只，造模組剩余41只，完全清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均為0分，造模組大鼠2例評(píng)分為0分，不符合實(shí)驗(yàn)要求，予以剔除，剩余39只。與假手術(shù)組比較，造模組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著增高(P<0.01)。見表1。

表1 造模后2組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 分，

與假手術(shù)組比較，aP<0.01

2.1.2 TTC染色 再灌注后2h，從假手術(shù)組和造模組中各隨機(jī)抽取1只大鼠，過量麻醉處死取腦，進(jìn)行TTC染色，結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織呈鮮紅色，未見明顯蒼白區(qū)；造模組大鼠右側(cè)顳葉區(qū)呈蒼白色，為梗死灶所在(見圖1)。

圖1 再灌注后2組大鼠腦組織梗死灶TTC染色

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察

2.2.1 生存情況 模型評(píng)價(jià)后，將模型復(fù)制成功的39只大鼠隨機(jī)分為2組，非穴區(qū)對(duì)照組20只、針刺組19只。針刺干預(yù)期間，非穴區(qū)對(duì)照組死亡5只，針刺組死亡3只。假手術(shù)組大鼠傷口基本愈合，活動(dòng)度良好，毛色純白，富有光澤。非穴區(qū)對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)較差，毛色枯槁無光澤，活動(dòng)較少。針刺組大鼠精神狀態(tài)尚可，活動(dòng)范圍較小，但活動(dòng)度明顯好于非穴區(qū)對(duì)照組。

2.2.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 針刺干預(yù)后，各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，非穴區(qū)對(duì)照組和針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.01)；與非穴區(qū)對(duì)照組比較，針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 干預(yù)后3組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 分，

與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與非穴區(qū)對(duì)照組比較，bP<0.01

2.3 3組大鼠腦組織病理變化 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織未見異常；非穴區(qū)對(duì)照組大鼠腦組織因液化壞死而出現(xiàn)局部脫片現(xiàn)象(照片中箭頭所示)，高倍鏡下可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(照片中黑色三角所示)，梗死區(qū)內(nèi)可見細(xì)胞萎縮壞死，半暗帶組織中可見細(xì)胞水腫等改變；針刺組大鼠腦組織梗死灶區(qū)域也出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，但與非穴區(qū)對(duì)照組比較，范圍明顯變小，高倍鏡下炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕(見圖2)。

假手術(shù)組 非穴區(qū)對(duì)照組 針刺組

2.4 3組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量比較 檢測(cè)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，非穴區(qū)對(duì)照組和針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.01)；與非穴區(qū)對(duì)照組比較，針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 干預(yù)后3組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量比較

與假手術(shù)組比較，aP<0.01，與非穴區(qū)對(duì)照組比較，bP<0.01

3 討論

腦梗死因高發(fā)病率、高致死率和高致殘率而受到腦血管病研究者們的高度重視。早在1986年，Bederson等[8]就采用線栓法成功復(fù)制出與臨床腦梗死疾病高度相似的動(dòng)物模型。本研究采用的動(dòng)物模型復(fù)制方法為改良線栓法。結(jié)果證明，造模組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著高于假手術(shù)組，并且隨機(jī)抽取的大鼠腦組織TTC染色也在造模組大鼠腦切片上檢測(cè)到明顯的蒼白區(qū)，證實(shí)模型復(fù)制成功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了針刺百會(huì)、四神聰穴對(duì)缺血性腦病的良好療效：與假手術(shù)組比較，非穴區(qū)對(duì)照組和針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織梗死百分比顯著升高；與非穴區(qū)對(duì)照組比較，針刺組顯著降低了MCAO模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦組織梗死百分比。病理結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織未見異常；非穴區(qū)對(duì)照組大鼠腦組織因液化壞死而出現(xiàn)局部脫片現(xiàn)象，高倍鏡下可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，梗死區(qū)內(nèi)可見細(xì)胞萎縮壞死，半暗帶組織中可見細(xì)胞水腫等改變；針刺組大鼠腦組織梗死灶區(qū)域也出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，但與非穴區(qū)對(duì)照組比較，范圍明顯變小，高倍鏡下炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕。結(jié)果提示，針刺百會(huì)、四神聰穴對(duì)MCAO模型大鼠的腦保護(hù)作用主要在于能夠減輕梗死區(qū)及缺血半暗帶腦組織中的炎癥反應(yīng)。

免疫細(xì)胞的增殖、分化以及生物學(xué)作用的發(fā)揮受到一系列細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。根據(jù)細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)的同源性可將其分為幾個(gè)蛋白質(zhì)家族：如IL-1家族、IL-6家族、腫瘤壞死因子家族、IL-10家族和造血因子家族等[11]。IL-1是一種致炎細(xì)胞因子，廣泛參與了人體組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程。研究表明，IL-1具有明顯的促炎作用，又被稱為前沿性細(xì)胞因子。IL-1在腦梗死的發(fā)生的早期，發(fā)揮著重要的致炎作用[12-13]。IL-6主要由活化的T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌，其最主要的生物學(xué)作用也是促炎作用，此外還具有刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體等免疫學(xué)功能。研究表明，IL-6在腦梗死發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要的促炎作用[14]。TNF，主要由活化的巨噬細(xì)胞分泌，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的功能。近年來的研究表明，在腦梗死的發(fā)生早期，也有TNF-α參與其中，主要發(fā)揮介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用[15]。

本研究結(jié)果顯示，非穴區(qū)對(duì)照組和針刺組大鼠缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著升高，針刺百會(huì)、四神聰穴干預(yù)后，含量顯著降低。結(jié)果提示，當(dāng)腦缺血損傷發(fā)生時(shí)，缺血半暗帶腦組織中迅速發(fā)生了炎癥反應(yīng)，缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α含量迅速升高。而針刺百會(huì)、四神聰穴干預(yù)后，IL-1、IL-6、TNF-α含量顯著降低，說明針刺百會(huì)、四神聰穴對(duì)IL-1、IL-6、TNF-α的分泌具有一定的抑制作用，從而發(fā)揮針刺對(duì)MCAO模型大鼠的腦保護(hù)作用。

綜上所述，針刺百會(huì)、四神聰穴對(duì)MCAO模型大鼠具有一定的抗炎作用，該作用可能是通過抑制缺血半暗帶腦組織中IL-1、IL-6、TNF-α分泌而實(shí)現(xiàn)的，但其抑制IL-1、IL-6、TNF-α分泌的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。