江增宏，周民舉

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院,安徽 合肥 230000；2.巢湖市中醫(yī)院,安徽 巢湖 238000)

神經(jīng)病理性疼痛是由感覺神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷引起的疼痛，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量并造成個人和社會的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[1]。與急性疼痛不同，神經(jīng)病理性疼痛是一種慢性疼痛，這對于治療是個巨大的挑戰(zhàn)[2]。近年來，人們越來越認(rèn)識到非神經(jīng)元細(xì)胞如免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞)在慢性疼痛中起著關(guān)鍵作用[3]。神經(jīng)損傷后引起脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，釋放神經(jīng)介質(zhì)誘發(fā)神經(jīng)病理性疼痛[3]。大量的研究表明激活MAPKs(p38、ERK、JNK)在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4]。神經(jīng)損傷或脊髓受損時都能誘導(dǎo)脊髓MAPKs磷酸化水平增加。MAPKs通過激活不同類型的膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)慢性疼痛進(jìn)程的不同階段[5]。在動物模型中，抑制p38、ERK或者JNK均能抑制慢性疼痛[5]。

杜仲多糖(Eucommia ulmoides Oliv Polysaccharide，EOP)是從中藥杜仲干燥樹皮中提取的活性成分，有研究發(fā)現(xiàn)其具有提高免疫、抗炎、抗腫瘤、降血糖的藥理作用[6-7]，此外，還有研究發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)痛作用[8]。本實驗利用神經(jīng)病理性疼痛經(jīng)典CCI模型，探索杜仲多糖是否抑制CCI大鼠的機械學(xué)痛覺超敏，并淺析其可能的鎮(zhèn)痛機制。

1 材料與方法

1.1主要藥品與試劑EOP由我院天然藥化實驗室采用水提醇沉法提取，含量54.23%。GAPDH抗體(Bio-Rad公司)，p-p38抗體(Millipore公司)，p-JNK抗體(Cell Signaling Technology公司)，p-ERK抗體(Cell Signaling Technology公司)，兔抗、鼠抗(R&D公司)，IBA-1兔源抗體(Abcam公司)，GFAP鼠源抗體(Millipore公司)，驢抗兔熒光二抗、驢抗鼠熒光二抗(Jackson Lab公司)。

1.2實驗動物與分組健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重在160～240 g之間，購于浙江省實驗動物中心，對動物處置符合動物倫理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。隨機將SD大鼠分成對照組、模型組和EOP給藥組，EPO給藥有3個劑量：低劑量(60 mg·kg-1)、中劑量組(120 mg·kg-1)、高劑量組(240 mg·kg-1)。

1.3神經(jīng)病理性疼痛模型制備參照文獻(xiàn)[9]制備坐骨神經(jīng)慢性壓迫(CCI)模型：成年大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，鈍性縱向分離肌肉直至暴露坐骨神經(jīng)，羊腸線(4.0)輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)中段，共4道。對照組分離暴露坐骨神經(jīng)不行結(jié)扎。術(shù)后7天用Von Frey 測痛包(美國DanMic Global公司)測定機械閾值下降40%以上視為造模成功，投入實驗。

1.4機械縮足反應(yīng)閾測定方法測定：現(xiàn)將實驗大鼠放入有機玻璃箱，待穩(wěn)定后，用Von Frey纖維絲垂直刺激雙足底中部，刺激力度從低到高，出現(xiàn)抬足或添足即為陽性。造模7天后，模型組腹腔注射生理鹽水2 mL，EOP低劑量給藥組、EOP中劑量給藥組、EOP高劑量給藥組，分別測定3組給藥后0.5 h，2 h，4 h，8 h，24 h的機械縮足反應(yīng)閾。

1.5蛋白定量檢測造模后14 d每組取4只大鼠，對照組和模型組腹腔注射生理鹽水2 mL，EOP給藥組(120 mg·kg-1)，2 h后水合氯醛麻醉后，取L4～6脊髓，-80 ℃冰箱保存，采用western blot方法檢測脊髓中p-p38、p-JNK和p-ERK的蛋白表達(dá)。

1.6免疫熒光標(biāo)記造模后14 d開始，對照組、模型組和EOP給藥組分別腹腔給予生理鹽水、生理鹽水和EOP(120 mg·kg-1)連續(xù)腹腔給藥5 d，每天一次，于第5 d給藥后2 h取材。大鼠水合氯醛麻醉后，用0.01MPBS和4%多聚甲醛緩沖液灌注后，取L4～6脊髓固定、脫水、包埋、切片(熒光片厚30 μm)，每個標(biāo)本取3張分別進(jìn)行IBA-1和GFAP的免疫熒光標(biāo)記，用Image J軟件進(jìn)行平均熒光強度的計算。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析，兩兩組間采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同劑量杜仲多糖單次給藥對CCI大鼠機械學(xué)痛覺超敏的影響由圖1所示，和模型組相比，3個劑量的EOP單次腹腔給藥都有明顯的鎮(zhèn)痛作用(P<0.05)，且表現(xiàn)出劑量相關(guān)性，高劑量給藥組給藥后2 h鎮(zhèn)痛作用幾乎可以逆轉(zhuǎn)CCI誘導(dǎo)的機械學(xué)痛覺超敏。此外，中、高劑量組鎮(zhèn)痛作用長達(dá)4 h。

注：組間采用t檢驗,與模型組相比，# P<0.05，## P<0.01。

2.2杜仲多糖多次給藥對CCI活化的膠質(zhì)細(xì)胞的影響免疫熒光標(biāo)記結(jié)果(圖2)顯示：與對照組相比，造模后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均明顯活化(P<0.05)；但是EOP(120 mg·kg-1)連續(xù)給藥5 d后，CCI大鼠脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯減輕(P<0.05)，但是對于CCI活化的小膠質(zhì)細(xì)胞EOP連續(xù)給藥沒有顯著影響(P>0.05)。

注：與對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3杜仲多糖對CCI大鼠脊髓p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白水平表達(dá)的影響免疫蛋白印記結(jié)果(圖3)所示：與對照組相比，模型組大鼠脊髓的p-p38、p-JNK、p-ERK三種蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。EOP低劑量給藥組對CCI誘導(dǎo)的脊髓MAPKs蛋白高表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響。中、高劑量EOP給藥組能夠顯著降低模型組升高的p-JNK和p-ERK蛋白水平(P<0.05)，但是對CCI模型脊髓p-p38的高表達(dá)水平?jīng)]有顯著作用(P>0.05)。

注：與對照組相比，# P<0.05，## P<0.01；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

杜仲具有補肝腎，治腰脊酸疼，安胎等功效，藥用部位為干燥皮，杜仲多糖為杜仲干燥皮的水溶性多糖成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有良好的免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤以及降血糖的作用[6-7]。周程艷等[8]研究發(fā)現(xiàn)杜仲水提取物對熱板致痛、醋酸致痛模型有抗炎鎮(zhèn)痛效果。

本研究發(fā)現(xiàn)杜仲多糖能夠?qū)ι窠?jīng)病理性疼痛的機械學(xué)超敏有抑制作用，并且具有劑量依賴性，高劑量給藥幾乎可以逆轉(zhuǎn)CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛機械學(xué)超敏，如圖1所示，因此，本研究證實杜仲多糖對于CCI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用。

神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展研究經(jīng)歷漫長的過程，起初研究者們普遍認(rèn)為慢性疼痛的病理生理機制只和神經(jīng)元異常興奮誘導(dǎo)的損傷、凋亡有關(guān)[1]。但是，后來越來越多的研究證實，除了神經(jīng)元，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛的病理過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要作用[5]。其中，神經(jīng)損傷時，引起脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞(占膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的40%～50%)大量活化，它表現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸蛋白(Glial fibrillary acidicprotein，GFAP)表達(dá)上調(diào)[10]。本文探索了杜仲多糖對CCI誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，而IBA-1為小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。在免疫熒光技術(shù)下，我們發(fā)現(xiàn)杜仲多糖主要抑制了CCI誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路是被證實在神經(jīng)病理性疼痛誘導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞活化過程中重要的通路之一[4]。MAPK信號通路包括p38絲裂原活化蛋白激酶(p38)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular signal-regulated kinase1、2 ，ERK)三個主要成員。研究表明MAPK三個主要成員在膠質(zhì)細(xì)胞上的分布具有自身特點，神經(jīng)損傷，術(shù)后疼痛，嗎啡耐受模型等脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞上p-p38表達(dá)顯著上調(diào)[11]。小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的主要是p38β亞型，而p38α亞型主要表達(dá)在神經(jīng)元和坐骨神經(jīng)。目前研究JNK有三種亞型，其中JNK1主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞上[12]，實驗表明，神經(jīng)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞和DRG神經(jīng)元上JNK持續(xù)激活[12]。而ERK的表達(dá)較為有趣，早期的ERK激活在小膠質(zhì)細(xì)胞，而神經(jīng)損傷后期ERK又轉(zhuǎn)變到星形膠質(zhì)細(xì)胞[13]。本實驗探索了EOP對MAPK信號通路三個成員的影響，發(fā)現(xiàn)EOP對神經(jīng)損傷后高表達(dá)的p-JNK和p-ERK有抑制作用，而對p-p38沒有明顯抑制作用，其結(jié)果表明，EOP的鎮(zhèn)痛作用與JNK/ ERK MAPK信號通路有關(guān)，這可與免疫熒光結(jié)果有關(guān)，EOP僅能顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化相同。