王向棟，李 會(huì)，陳志蔚,蔡兆培,史勁松，許正宏

(1. 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122；2. 大豐市佳豐油脂有限責(zé)任公司，江蘇鹽城224100; 3.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

甾體藥物是世界上僅次于抗生素的第二大類藥物[1-2]，對(duì)機(jī)體的生命活動(dòng)起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，例如糖皮質(zhì)激素是臨床應(yīng)用最為廣泛的抗炎藥物[3]。9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一類重要的甾體藥物中間體，因其獨(dú)特的9位羥基，可利用化學(xué)方法引入一個(gè)鹵族原子，同時(shí)在C11β-位上形成重要的功能羥基，由此衍生的鹵代類甾體藥物的抗炎、抗敏效果更加明顯，藥效時(shí)間也更為持久[4]。依靠微生物強(qiáng)大及復(fù)雜的酶催化體系特異制備甾體藥物中間體，可有效簡(jiǎn)化工藝路線、提高催化選擇性和整體的收率[5-6]。因此，9α-OH-AD的微生物合成越來越受到關(guān)注[7-8]。

在甾體的微生物轉(zhuǎn)化過程中，培養(yǎng)基中的各種組分以及培養(yǎng)條件對(duì)菌株的生長(zhǎng)以及胞內(nèi)酶系的表達(dá)都具有很大的影響[9-10]，因此，發(fā)酵工藝優(yōu)化是有效提高9α-OH-AD產(chǎn)量的途徑之一[11]。通過單因素實(shí)驗(yàn)考察培養(yǎng)基各組分對(duì)菌體轉(zhuǎn)化的影響，是目前常用的培養(yǎng)基組分優(yōu)化方式[12]。然而單因素實(shí)驗(yàn)往往無法綜合考慮各因素之間的相互作用，因此嘗試通過正交試驗(yàn)快速有效地確定各組分的最優(yōu)條件。正交試驗(yàn)是研究多因素多水平的一種方法，近年來采用正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化已取得了較好的結(jié)果[13-14]。

課題組在前期獲得1株分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)LY-1，能轉(zhuǎn)化植物甾醇制備9α-OH-AD，具有較強(qiáng)的羥化能力。在前期研究中，改進(jìn)了底物投料方式，目的產(chǎn)物9α-OH-AD的產(chǎn)量有明顯提升[15]。然而9α-OH-AD的產(chǎn)物得率仍存在一定的不足，本研究中，筆者以分枝桿菌LY-1作為出發(fā)菌株，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定最適培養(yǎng)基的各個(gè)成分，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，進(jìn)一步提高目的產(chǎn)物9α-OH-AD的得率，為后續(xù)的分子改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

分枝桿菌LY-1保存在江南大學(xué)微生物制藥與系統(tǒng)發(fā)酵研究室。植物甾醇(β-谷甾醇47.0%，菜油甾醇24.6%，豆甾醇15.5%，菜籽甾醇3.4%)，湖北巨勝科技有限公司；9α-OH-AD(純度大于98.0%)，上海瀚香生物科技有限公司；金龍魚牌大豆油、玉米漿，安徽華恒生物科技股份公司；酵母粉，美國(guó)Oxoid公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200、葡萄糖 20、瓊脂 20。

種子培養(yǎng)基(g/L)：NaNO35.4、酵母粉 15、甘油 2.0、(NH4)2HPO40.6。

斜面培養(yǎng)基(g/L)：NaNO35.4、酵母粉 15、甘油 2.0、(NH4)2HPO40.6、瓊脂 2.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：NaNO35.4、玉米漿20、(NH4)2HPO40.6、植物甾醇15；pH 8.0。

1.3 方法

1.3.1 分枝桿菌LY-1的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化

挑取單菌落接種于50 mL種子培養(yǎng)基中(250 mL搖瓶)。在往復(fù)式恒溫?fù)u床(30 ℃、120 r/min)中培養(yǎng)2～3 d，轉(zhuǎn)接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(500 mL搖瓶)中，接種量為1%(體積分?jǐn)?shù))，置于搖床上，發(fā)酵周期為7 d，培養(yǎng)條件為30 ℃、120 r/min。

1.3.2 分枝桿菌LY-1培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

1)碳源優(yōu)化。分別選取可能有利于目的產(chǎn)物積累的糖類物質(zhì)，包括糖蜜、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘油，代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，以玉米漿作對(duì)照，同時(shí)保持培養(yǎng)基中的含碳水平不變(含碳水平為2%的玉米漿)，按照1.3.1節(jié)中的方法進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化結(jié)束后用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定產(chǎn)量。

2)氮源優(yōu)化。分別用不同的氮源((NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl、牛肉膏)代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，以NaNO3作對(duì)照，保持發(fā)酵培養(yǎng)基中含氮水平不變(含氮水平為0.54%的NaNO3)。

3)磷酸鹽優(yōu)化。分別用不同的磷酸鹽(NH4H2PO4、KH2PO4、K2HPO4和NaH2PO4)代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽，以(NH4)2HPO4作對(duì)照，保持發(fā)酵培養(yǎng)基中的含氮量不變(含氮水平為0.06%的(NH4)2HPO4)。

4)金屬離子優(yōu)化。分別選用ZnSO4、MgSO4、FeSO4、FeCl3、NiCl2、CuSO4、CaCl2和MnCl2等金屬鹽化合物，考察其對(duì)菌體轉(zhuǎn)化的影響。

1.3.3 培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取最佳組分為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)5因素4水平的正交試驗(yàn)，以此來確定最佳培養(yǎng)基組成。

1.3.4 培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

1)pH優(yōu)化。已知pH在7.5～8.5，更適合分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇積累9α-OH-AD，因此選取了pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0這6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行pH優(yōu)化。

2)接種量?jī)?yōu)化。原接種量為1%，因此選取了接種量為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0%這6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行接種量?jī)?yōu)化。

3)溫度優(yōu)化。已知溫度在28～30 ℃，更適合分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇積累9α-OH-AD，因此選取24、26、28、30和32 ℃這5個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析方法

1)分枝桿菌LY-1生物量的測(cè)定。在發(fā)酵過程中，取1 mL發(fā)酵液于無菌的2 mL EP管，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清。分別加入1 mL乙酸乙酯，1 000 r/min充分振蕩15～30 min，在4 ℃下12 000 r/min離心10～15 min，棄上清。用乙酸乙酯洗2次，收集菌體，烘干至恒質(zhì)量，稱量。

2)產(chǎn)物萃取。在發(fā)酵過程中，每12 h取500 μL發(fā)酵液于無菌的EP管，加入500 μL乙酸乙酯，1 000 r/min充分振蕩20～30 min。振蕩結(jié)束后，靜置分層，吸取上層乙酸乙酯于5 mL無菌EP管中。重復(fù)5次，將乙酸乙酯合并。室溫下用氮吹儀將其濃縮，若產(chǎn)物濃度較大則出現(xiàn)白色結(jié)晶。在裝有烘干產(chǎn)物的5 mL無菌EP管中，加入4 mL乙腈復(fù)溶后，HPLC檢測(cè)。

3)利用HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物。以外標(biāo)法進(jìn)行產(chǎn)物定量，色譜柱規(guī)格為Agilent TC-C18、4.6 mm×250 mm、5 μm，流動(dòng)相為乙腈和水(兩者體積比為7∶ 3)，柱溫為30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

產(chǎn)物濃度的計(jì)算見式(1)，產(chǎn)物得率的計(jì)算見式(2)。

ρ1=A1ρ0D/A0

(1)

Y1=ρ1M2/ρ2M1×100%

(2)

式中：ρ1為產(chǎn)物質(zhì)量濃度(g/L)，ρ0為標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度(g/L)，ρ2為底物質(zhì)量濃度(g/L)，A0為標(biāo)樣HPLC檢測(cè)譜峰面積，A1為產(chǎn)物HPLC檢測(cè)譜峰面積，Y1為產(chǎn)物摩爾得率，D為樣品的稀釋倍數(shù)，M1為產(chǎn)物摩爾質(zhì)量，M2為底物摩爾質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化結(jié)果

分枝桿菌LY-1發(fā)酵培養(yǎng)基中僅含有玉米漿、NaNO3和(NH4)2HPO4，與已報(bào)道的培養(yǎng)基相比[16-17]，除碳源成分不明確外，還缺少金屬離子等微量元素，因此嘗試通過單因素優(yōu)化確定最適組分。

2.1.1 碳源優(yōu)化結(jié)果

碳源是微生物生長(zhǎng)所需的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以玉米漿作為氮源，但同樣含有少量成分可用作碳源[18]。而姜博等[19]發(fā)現(xiàn)玉米漿在培養(yǎng)基中作為碳源要優(yōu)于葡萄糖。因此碳源優(yōu)化時(shí)，對(duì)2種情況進(jìn)行優(yōu)化和比較，結(jié)果見圖1。

由圖1(a)可以看出：在不同碳源條件下，菌體的生物量都有不同程度提高，但目的產(chǎn)物9α-OH-AD的得率明顯降低。當(dāng)糖蜜替代玉米漿后，9α-OH-AD的得率僅達(dá)到24.2%，而其他碳源的產(chǎn)物得率基本都小于10%。可能的原因是糖蜜和玉米漿一樣屬于成分復(fù)雜的物質(zhì)，其中還含有氨基酸、生物素等，因此當(dāng)玉米漿被糖蜜替代后，對(duì)菌體轉(zhuǎn)化的影響較少。而其他糖類替代后，由于培養(yǎng)基中成分單一，且沒有其他一些營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致菌體轉(zhuǎn)化能力下降。

圖1 碳源對(duì)菌體轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on trans- formation and growth of strain LY-1

由圖1(b)可知：在玉米漿存在的情況下，添加其他碳源物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)物得率基本都有所下降，而生物量則有明顯提高。如，添加葡萄糖后，產(chǎn)物得率最低，僅為18.5%，但生物量明顯提高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物的積累增多，表明葡萄糖的添加雖然能提高菌體還原力[20]，但葡萄糖并不利于9α-OH-AD的積累。同時(shí)比較發(fā)現(xiàn)，添加可溶性淀粉后，產(chǎn)物得率有微弱提高，但考慮成本因素，1%的添加量相對(duì)于提高的程度，并不符合后期的應(yīng)用；而添加麥芽糖和糖蜜后，兩者的產(chǎn)物得率都明顯降低。因此，選擇最佳碳源為玉米漿。

2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

氮源是構(gòu)成微生物細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，主要分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。分枝桿菌LY-1以NaNO3作為初始氮源，優(yōu)化研究選用常見的幾種氮源替代NaNO3，考察菌體轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 氮源對(duì)菌體轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources for transformation and growth of strain LY-1

從圖2可以看出：不同氮源替換后，菌體生物量與對(duì)照相比無顯著性差異。以KNO3作為氮源時(shí)，9α-OH-AD的得率最高，達(dá)到39.5%，表明微生物能夠較快利用無機(jī)氮源；而蛋白胨和牛肉膏作氮源時(shí)，菌體轉(zhuǎn)化效率較差，表明遲效性氮源不利于菌體利用，反而影響菌體的轉(zhuǎn)化能力；以NH4Cl作為氮源時(shí)，產(chǎn)物得率最低，因?yàn)镹H4Cl是生理酸性物質(zhì)，當(dāng)NH4+進(jìn)入代謝后，不利于菌體轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。因此，選擇KNO3作為最適氮源用于后續(xù)研究。

2.1.3 磷酸鹽優(yōu)化結(jié)果

磷作為生物大分子的主要成分之一，對(duì)于菌體能荷狀態(tài)的改變具有重要作用。培養(yǎng)基中的磷酸鹽雖然含量較少，但微生物對(duì)不同的磷酸鹽利用效果不盡相同，此外磷酸鹽還會(huì)影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程中pH的調(diào)節(jié)，因此有必要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖3。

圖3 磷酸鹽對(duì)菌體轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different phosphates for transformation and growth of strain LY-1

由圖3可看出：添加NaH2PO4后菌體的轉(zhuǎn)化效果最好，9α-OH-AD的產(chǎn)物得率為42.1%；而添加K2HPO4后，產(chǎn)物得率與對(duì)照相比無顯著性差異。與氮源優(yōu)化相似，K+的添加都有利于產(chǎn)物的積累，但添加KH2PO4和NH4H2PO4后，菌體的轉(zhuǎn)化效率反而降低。因此，選擇NaH2PO4作為最適磷酸鹽。

2.1.4 金屬離子優(yōu)化結(jié)果

部分微量元素作為酶的輔基和激活劑，低濃度時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成有促進(jìn)作用，高濃度時(shí)反而出現(xiàn)抑制作用。考察添加不同金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知：當(dāng)添加FeSO4、CaCl2和FeCl3時(shí)，與對(duì)照相比，產(chǎn)物得率都有一定程度提高。其中Fe2+具有電子傳遞的作用，因此添加到培養(yǎng)基中對(duì)菌體轉(zhuǎn)化均有促進(jìn)作用，Ca2+有利于提高側(cè)鏈降解相關(guān)酶的活性。相反，添加Ni2+和Cu2+后，產(chǎn)物得率不足8%，表明其對(duì)菌體轉(zhuǎn)化有明顯的抑制作用。因此，選擇CaCl2和FeSO4作為無機(jī)離子的添加，進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 正交試驗(yàn)確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基

通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取玉米漿、KNO3、NaH2PO4、FeSO4和CaCl2為考察對(duì)象，設(shè)計(jì)5因素4水平的正交試驗(yàn)，以確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

圖4 金屬離子對(duì)菌體轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of different metal ion for transformation and growth of strain LY-1

表1 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 L16(45) 正交試驗(yàn)分析表

由表2可知：5種因素對(duì)產(chǎn)物得率的影響程度從大到小依次為CaCl2、NaH2PO4、KNO3、玉米粉、FeSO4，最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為A2B1C4D3E1，即玉米漿30 g/L、KNO34.0 g/L、NaH2PO41.2 g/L、FeSO40.075 g/L及CaCl20.1 g/L。在此最適培養(yǎng)基條件下，植物甾醇投料質(zhì)量濃度為15 g/L，搖瓶轉(zhuǎn)化168 h，驗(yàn)證并重復(fù)3次，產(chǎn)物得率達(dá)到43.9%～44.9%。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 接種量?jī)?yōu)化結(jié)果

在發(fā)酵過程中，接種量的多少會(huì)直接影響到菌體在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖的速度，因此，適當(dāng)?shù)慕臃N量是菌體發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素。當(dāng)接種量過小時(shí)，菌體初始濃度過低，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期增長(zhǎng)，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)產(chǎn)率較低；而當(dāng)接種量過大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致菌體過快生長(zhǎng)，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)消耗過快和溶氧不足，菌體容易衰老和自溶，影響菌體的轉(zhuǎn)化效率?？疾旖臃N量對(duì)發(fā)酵過程的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 接種量對(duì)菌體轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of inoculum concentration on transformation of strain LY-1

由圖5可以看出：當(dāng)接種量較低時(shí)，菌體的轉(zhuǎn)化效率較低；隨著接種量的增加，產(chǎn)物得率也隨之增加；當(dāng)接種量為2%時(shí)，產(chǎn)物9α-OH-AD得率達(dá)到46.2%，相對(duì)于初始的接種量1%，有一定程度地提高；而接種量超過2%時(shí)，產(chǎn)物得率也隨之降低，表明高的接種量并不利于目的產(chǎn)物的積累。由于目的產(chǎn)物的積累與菌體生長(zhǎng)相耦聯(lián)，因此，過高的接種量縮短了對(duì)數(shù)期，一定程度上也減少了菌體適應(yīng)和轉(zhuǎn)化的時(shí)間。

2.3.2 pH優(yōu)化結(jié)果

在自然界中，微生物都有其最適的pH范圍。通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中9α-OH-AD的含量，結(jié)果如圖6所示。

圖6 pH對(duì)菌體轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of pH on transformation and growth of strain LY-1

由圖6可知：分枝桿菌的初始pH為7.5～8.5時(shí)，菌體的轉(zhuǎn)化效果較好，這與文獻(xiàn)[11,21]報(bào)道一致。同時(shí)，生物量變化趨勢(shì)與產(chǎn)物積累相同，表明產(chǎn)物積累的差異是因?yàn)閜H直接影響菌體的生長(zhǎng)，從而間接影響產(chǎn)物得率。當(dāng)初始pH為8.0時(shí)，菌體的產(chǎn)物得率最高。因此，確定最適起始pH為8.0。

2.3.3 溫度優(yōu)化結(jié)果

溫度是影響菌體生長(zhǎng)的重要因素，溫度對(duì)培養(yǎng)基中的溶氧量、發(fā)酵過程中各個(gè)酶系的反應(yīng)速率和目的產(chǎn)物的生成速率等有著重要的影響，還通過改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)來影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。因此，研究溫度對(duì)菌體轉(zhuǎn)化過程的影響非常重要?？疾鞙囟葘?duì)菌體轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 溫度對(duì)菌體轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effect of temperature on transformation of strain LY-1

由圖7可以看出：隨著溫度的增加，轉(zhuǎn)化效率也隨之增加，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，9α-OH-AD的得率最高，而溫度超過30 ℃時(shí)，目的產(chǎn)物的得率迅速下降，因此確定30 ℃為最適轉(zhuǎn)化溫度。

綜上，最終確定適宜的發(fā)酵條件為pH 8.0，接種量2%，溫度30 ℃。在此條件下，產(chǎn)物得率達(dá)到46.2%～47.0%，比優(yōu)化前的結(jié)果提高了約22.1%，9α-OH-AD的產(chǎn)量最高達(dá)到5.21 g/L,與初始轉(zhuǎn)化工藝相比提高了22.1%，與目前國(guó)內(nèi)外微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的研究相比[7,9]，仍然處于較高水平。

近年來，國(guó)內(nèi)外研究者通過解析3-甾酮-9α-羥基化酶[22-23]，采用分子改造手段提高9α-OH-AD產(chǎn)量，其中袁家代等[24]在分枝桿菌中異源表達(dá)3-甾酮-9α-羥基化酶基因，構(gòu)建了產(chǎn)9α-OH-AD的菌株，但9α-OH-AD的含量?jī)H為0.453 mg/L。王貴娥等[25]在分枝桿菌中強(qiáng)化表達(dá)了3-甾酮-9α-羥基化酶，9α-OH-AD的含量達(dá)到1.443 g/L，較出發(fā)菌提高了50.78%。

對(duì)該菌株產(chǎn)9α-OH-AD的機(jī)制研究正在進(jìn)行之中，通過代謝工程等手段進(jìn)一步提高菌株LY-1生產(chǎn)9α-OH-AD的能力是后續(xù)工作的研究方向。

3 結(jié)論

對(duì)培養(yǎng)基各成分進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最終確定分枝桿菌LY-1轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的最適培養(yǎng)基各組分。在此基礎(chǔ)上，對(duì)選擇的各組分進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，最終確定最適培養(yǎng)基為玉米漿30 g/L、KNO34.0 g/L、NaH2PO41.2 g/L、FeSO40.075 g/L及CaCl20.10 g/L；而后，再次通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件，最終確定適宜的培養(yǎng)條件為pH 8.0，接種量為2%，溫度為30 ℃，在此條件下，9α-OH-AD的得率可達(dá)46.2%～47.0%。