孫家奪，吳 斌，何冰芳

(1. 上海澤潤生物科技有限公司，上海201203；2. 南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800； 3. 南京工業(yè)大學藥學院，江蘇南京211800)

D-乳酸是多種手性化合物的合成前體，已廣泛應用于化工、制藥領(lǐng)域[1-2]。近年來發(fā)現(xiàn)其在提高聚乳酸材料的熱穩(wěn)定性、力學強度等方面具有顯著作用，引起許多學者的研究興趣[1,3-4]。

在D-乳酸發(fā)酵中，常使用葡萄糖為碳源，這使得發(fā)酵的碳源成本居高不下[4-5]。另外，在乳酸菌發(fā)酵過中，還需要額外添加某些維生素和氨基酸作為生長因子，酵母膏富含維生素和氨基酸，是常用的氮源，但其價格昂貴，使得氮源成本占到整個乳酸發(fā)酵成本的38%左右[6]。因此，尋找廉價物質(zhì)作為發(fā)酵的碳氮源成為降低乳酸發(fā)酵成本的必然趨勢[7-9]。玉米芯是玉米加工后剩下的廢棄物，富含木質(zhì)纖維素，可以水解為葡萄糖和木糖，是發(fā)酵工業(yè)極有價值的潛在碳源[9-10]。如張杰等[8]以稀硫酸處理的玉米芯水解液為原料，以細菌A-19為生產(chǎn)菌，發(fā)酵24 h，產(chǎn)生30.6 g/L的L-乳酸，轉(zhuǎn)化率82.6%。此外，我國有豐富的棉籽粕、花生粕和菜籽粕等含氮量較高的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，這些都是潛在的發(fā)酵氮源[11-12]。孫駿飛等[13]報道了菊糖芽孢乳桿菌YBS1-5利用麩皮的蛋白酶水解液和纖維素酶水解液替代葡萄糖和酵母粉發(fā)酵制備D-乳酸，發(fā)酵96 h，D-乳酸產(chǎn)量達99.5 g/L，生產(chǎn)速率達1.04 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率達89.1%；李媛等[14]通過以花生粕為氮源發(fā)酵，最終獲得100 g/L以上的D-乳酸。然而，關(guān)于利用農(nóng)業(yè)廢棄物作為D-乳酸發(fā)酵的碳和氮源的報道較少。

本研究中，筆者主要嘗試玉米芯酶解液替代葡萄糖，棉籽粕替代酵母膏，結(jié)合補料發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)D-乳酸，以期達到將農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢乳桿菌Sporolactobacillussp. YBS1-5(CCTCC M 2012516)是同型D-乳酸高產(chǎn)菌株[15]，保存于南京工業(yè)大學何冰芳教授實驗室。

酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉等，國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿，安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司；玉米芯，江蘇康威生物技術(shù)開發(fā)有限公司；棉籽粕、菜籽粕、豆粕及玉米胚芽粕，徐州天源糧食加工廠；酸性纖維素酶，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司(酶活力為555 FPU/L)。

1.3.4 玉米芯酶解液的制備

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 2 g、玉米漿 2 mL、KH2PO41 g、乙酸鈉 2 g、MgSO40.2 g；pH 7.0。

種子培養(yǎng)基(1 L)：葡萄糖 20 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 2 g、玉米漿5 mL、MgSO40.2 g、麩皮 2 g、CaCO314 g；pH 7.0，接種量10%(體積分數(shù))。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基(1 L)：玉米漿 15 mL、麩皮 15 g、MgSO40.5 g。

周大國嘆息一聲說：“能確認。唉，毛主任可是我們醫(yī)院的骨干，也是咱們江城有特別突出貢獻的中青年專家，真想不到啊，我希望警方能盡早破案，還死者與死者家屬一個公道。”

1.3 實驗方法

用接種環(huán)將平板菌轉(zhuǎn)接入裝液量為 150 mL(500 mL搖瓶)的種子培養(yǎng)基，液體石蠟液封，在37 ℃、150 r/min的條件下，厭氧培養(yǎng)16 h。

將保存于-80 ℃的菌種，接種到固體培養(yǎng)基，在37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)活化培養(yǎng)48 h后，再擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

其中，x(t)為液壓介質(zhì)被壓縮的長度減小量隨時間t變化的函數(shù)。由式(2)可以求解出產(chǎn)生半正弦波載荷的脈寬τ和壓力峰值pmax分別為

1.3.2 種子培養(yǎng)

CAP是老年人常見的呼吸系統(tǒng)疾病，由于老年人常合并多種慢性疾病，機體免疫力處于衰退期，因此，發(fā)生CAP風險較高[11]?；颊甙l(fā)病后，主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、發(fā)熱、呼吸困難等癥狀，嚴重可能引起感染性休克、呼吸衰竭等，具有較高的致死率[12]。機械通氣是改善CAP患者呼吸狀態(tài)的常用輔助手段，但由于需要進行插管等侵入性操作，增加了致病菌侵入呼吸道風險，可能引起VAP。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示[13]，機械通氣患者發(fā)生VAP比例可高達9%～70%。同時，VAP也是導致CAP患者死亡的主要原因之一。為穩(wěn)定患者生命體征，改善患者肺功能，降低死亡率，應對患者加強護理干預。

1.3.1 固體培養(yǎng)

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

1)氮源對菌株YBS1-5發(fā)酵D-乳酸的影響。以豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕、玉米胚芽粕和酵母膏分別作為發(fā)酵氮源，考察其對YBS1-5生長，D-乳酸的產(chǎn)量、光學純度和轉(zhuǎn)化率的影響。添加100 g/L的葡萄糖，并用60 g/L CaCO3做中和劑調(diào)節(jié)pH，轉(zhuǎn)速 150 r/min，培養(yǎng)溫度 37 ℃。發(fā)酵在搖瓶中進行。

2)棉籽粕用量對菌株YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響?？疾烀拮哑捎昧繉闥BS1-5生長，產(chǎn)D-乳酸的產(chǎn)量、光學純度和轉(zhuǎn)化率的影響。添加100 g/L的葡萄糖，并添加3 U/L中性蛋白酶，用10 mol/L的NaOH來維持發(fā)酵液pH為6.5。轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)溫度37 ℃。發(fā)酵在7 L發(fā)酵罐中進行。

姓李的老天爺撒手不管了，這可如何是好？天上的神仙可犯難了，最后大家一商量，到人間再去找一個老天爺。這個老天爺啊，一定要心地善良，做事公道、脾氣又好，才能勝任。

1.4.3 發(fā)酵液生物量的測定

中性蛋白酶(EC 3.4.24.28)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司，酶活力為1×104U/L；U-3000型高效液相色譜儀，賽默飛公司；SBA-40C型生物傳感儀及相關(guān)標準液和緩沖液，山東省科學院生物研究所；木糖標準品、糠醛標準品和香草醛標準品，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；雷磁PHS-3E型pH計，上海精密科學儀器有限公司；ATN-1100型凱氏定氮儀，上海洪紀儀器設備有限公司；Winpact發(fā)酵罐，Major Science公司。

唐詩的模糊美初探 ……………………………………………………………… 王華琴，張青華，張 紅（5．76）

玉米芯的處理方法主要參考Ouyang等[10]報道的方法，并適當修正。具體步驟：①將粉碎的玉米芯用30 g/L H2SO4浸泡2 h，接著125 ℃下蒸汽爆破5 min；②用水進行清洗至中性，過濾，接著將固體殘留物進行酶解。采用酸性纖維素酶進行水解，用量為15 FPU/g干物質(zhì)；水解條件為在50 ℃、200 r/min條件下反應60 h，固液比1∶ 4(g/mL)。反應結(jié)束后，8 000 r/min離心20 min，取上清4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 補料發(fā)酵

在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)以100 g/L的還原糖作為補料發(fā)酵的初始糖濃度能夠較好地消除底物抑制作用，因而將玉米芯酶解液稀釋到還原糖總質(zhì)量濃度為100 g/L，作為初始糖濃度進行D-乳酸發(fā)酵，發(fā)酵中添加3 U/L的中性蛋白酶發(fā)酵液和3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH維持發(fā)酵液pH 6.5進行補料發(fā)酵。轉(zhuǎn)速120 r/min，培養(yǎng)溫度 37 ℃。當葡萄糖質(zhì)量濃度降到30 g/L時，補加濃縮的玉米芯酶解液，使得發(fā)酵液中的初始還原糖糖濃度維持在100 g/L左右。發(fā)酵在7 L發(fā)酵罐中進行。

1.4 分析方法

1.4.1 總氮量的測定

采用凱氏定氮法進行測定。

參照文獻[15]，吸取一定量的發(fā)酵液于試管中，稀釋合適倍數(shù)，用752紫外分光光度計于660 nm處測定吸光值，乘以稀釋倍數(shù)得到其生物量OD660。

1.4.2 玉米芯酶解液成分的測定

1)葡萄糖和木糖含量測定。參照文獻[15]，采用SBA-40C型生物傳感分析儀進行測定。

2)木糖含量測定。參照文獻[16]，采用HPLC氨基柱法，木糖標準曲線：Y=2.65×峰面積-0.042，R2=0.999。

第四，企業(yè)法人。《湖南省關(guān)于城中村集體經(jīng)濟組織產(chǎn)權(quán)制度改革的指導意見》規(guī)定，只要集體經(jīng)濟組織愿意申請，根據(jù)自己自身的資產(chǎn)狀況，可以申請登記為有限責任公司。這里也是明確可以定位為企業(yè)法人。

3)糠醛和5-羥甲基糠醛含量檢測。參照文獻[17]，采用HPLC法測定，5-羥甲基糠醛標準曲線：Y=1.15×峰面積+5.77，R2=0.999 4；糠醛標準曲線：Y=1.29×峰面積+6.48，R2=0.999。

4)酚類含量檢測。參照文獻[18]，以香草醛標定酚類物質(zhì)的含量，香草醛標準曲線為Y=0.079×OD756-5.978，R2=0.999。

3)水解棉籽粕的中性蛋白酶用量對菌YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響?？疾熘行缘鞍酌甘褂昧窟^濾除菌加到培養(yǎng)基中水解棉籽粕對菌YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響。添加100 g/L的葡萄糖，并添加3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH 將發(fā)酵液pH 維持在6.5，轉(zhuǎn)速 120 r/min，培養(yǎng)溫度 37 ℃。發(fā)酵在7 L發(fā)酵罐中進行。

（1）對PM2.5檢測傳感器進行調(diào)試，對其實際響應聲光提示進行記錄，煙霧采集數(shù)據(jù)、聲光提示記錄如表1所示。

1.4.4 光學純度的鑒定

參照文獻[15]，發(fā)酵產(chǎn)物的光學純度采用HPLC進行檢測，標準曲線：Y=0.022 5×峰面積+0.018，R2=0.999，具體計算見式(1)。

綜合型實驗 此類實驗需學生在掌握相關(guān)專業(yè)基礎實驗操作能力的基礎上，使用多種實驗技術(shù)來完成最終實驗[9]。正是因為需要用到多種實驗技術(shù)，綜合型實驗對于儀器的開放性及實驗室的開放性要求更高。與基礎驗證型實驗相比，綜合型實驗更能鍛煉學生的協(xié)調(diào)能力，在專業(yè)實驗課中應當占有一定比例。

D-乳酸光學純度=

(1)

1.4.5 乳酸的定量分析

參照文獻[15]，采用高效液相色譜法分析。

有的公司雖然已經(jīng)認識到大數(shù)據(jù)對于企業(yè)發(fā)展的重要性，但是卻因為沒有較強的信息分析技術(shù)，導致數(shù)據(jù)的應用不能充分發(fā)揮其實際效用。我國很多企業(yè)受傳統(tǒng)思想的禁錮，不能用發(fā)展的眼光去看待問題，用陳舊的技術(shù)對待新的數(shù)據(jù)，導致其根本不能最好的發(fā)揮價值。長此以往，企業(yè)就會失去很多發(fā)展機會。

1.4.6 D-乳酸發(fā)酵過程中糖酸轉(zhuǎn)化率的分析

在同型D-乳酸發(fā)酵過程中，理論上1分子葡萄糖可以完全轉(zhuǎn)化為兩分子的D-乳酸，因此發(fā)酵過程中的糖酸轉(zhuǎn)化率具體計算見式(2)。

送走陳主任，呂凌子獨自來到與客廳相連的陽臺上，陽臺上有風，晾衣架上的衣服正在隨風搖擺。呂凌子目光空洞地望著遠方，一只黑色的小鳥從她面前一掠而過。呂凌子并不知道，此時此刻的劉麗芳同樣在陽臺上站著，就在自己腳下。兩位女人各懷心事，都在為同一件事情糾結(jié)。

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 氮源對菌株YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響結(jié)果

為了尋找可以替代酵母膏的廉價氮源，選擇4種農(nóng)業(yè)廢棄物——豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕以及玉米胚芽粕作為氮源。經(jīng)測定，酵母膏、豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕以及玉米胚芽粕的總氮量分別為5.8%、4.5%、6.2%、7.9%和4.2%，按照總用氮量與酵母膏相同的原則，最終它們的所用量分別為6.4、4.7、3.7和6.9 g/L。以60 g/L的CaCO3做中和劑，在搖瓶上考察不同種類氮源對菌株YBS1-5產(chǎn)D-乳酸的影響。其中將采用酵母膏做氮源時發(fā)酵所得到的D-乳酸糖酸轉(zhuǎn)化率視作100%，其他4種氮源發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸以此作為參考，所得的相對轉(zhuǎn)化率如圖1所示。由圖1可知：酵母膏、豆粕粉、菜籽粕、棉籽粕和玉米胚芽粕均可以不同程度地被菌株YBS1-5利用，其中，棉籽粕做氮源時D-乳酸的相對轉(zhuǎn)化率最高(71.3%)，這比豆粕粉、菜籽粕和玉米胚芽粕做氮源時要高，因此，選擇棉籽粕是替代酵母膏的潛在廉價氮源。

蘇楠想去楊小水老家看看，了解一下她的為人。這個想法與李嶠汝一拍即合。出了這事，李嶠汝才發(fā)現(xiàn)，她對母親幾乎不了解。農(nóng)村的母女或父子，大多都這樣，親情多，交流少。彼此的了解，除了衣食住行，所剩無幾。

圖1 氮源對菌株YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響Fig.1 Effects of different nitrogen sources on fermentation of D-Lactic Acid by YBS1-5

2.2 棉籽粕用量對菌YBS1-5產(chǎn)D-乳酸的影響結(jié)果

在添加3 U/L發(fā)酵液的中性蛋白酶條件下，用10 mol/L NaOH控制發(fā)酵液pH 6.5，考察棉籽粕用量(3.0、3.5、3.7、4.5和6.0 g/L)對菌YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響，結(jié)果見表1。

由表1可以看出，在一定的濃度范圍內(nèi)，菌YBS1-5產(chǎn)生的D-乳酸濃度隨著棉籽粕用量增加而增加，當添加3.5 g/L的棉籽粕時，以100 g/L的葡萄糖發(fā)酵得到D-乳酸72 g/L。因此，添加3.5 g/L的棉籽粕是較為合適用量。

表1 棉籽粕用量對YBS 1-5產(chǎn)D-乳酸的影響

2.3 中性蛋白酶用量對菌株YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響結(jié)果

在添加3.5 g/L的棉籽粕，用10 mol/L NaOH控制pH 6.5條件下，考察添加0、1.5、3.0、4.5、6.0和8.0 U/L的中性蛋白酶對菌株YBS1-5發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的影響,結(jié)果見圖2。

由圖2可知：在沒有添加中性蛋白酶的情況下，菌株YBS1-5不能有效地利用棉籽粕，100 g/L的葡萄糖僅產(chǎn)生了40 g/L的D-乳酸，轉(zhuǎn)化率僅為64%。當在發(fā)酵液中添加中性蛋白酶液時，菌YBS1-5產(chǎn)D-乳酸的用量也隨著所添加的中性蛋白酶液用量的增加而迅速增加。當中性蛋白酶的添加量為3 U/L時，菌株YBS 1-5產(chǎn)生72 g/L D-乳酸，轉(zhuǎn)化率為83%，說明棉籽粕水解較充分，氮源釋放較完全，而當添加的中性蛋白酶液超過4.5 U/L時，D-乳酸的產(chǎn)量下降明顯，可能是由于少量中性蛋白酶液殘留所致。同時出于成本考慮，選擇3 U/L的中性蛋白酶作為最適添加量。

圖2 中性蛋白酶用量對菌YBS1-5產(chǎn)D-乳酸的影響Fig.2 Effects of different neutral protease usages on production of D-Lactic acid by YBS1-5

2.4 補料發(fā)酵的結(jié)果

經(jīng)檢測，玉米芯酶解液的主要成分：100 g/L葡萄糖、13 g/L木糖、0.97 g/L糠醛、9.4 g/L 5-羥甲基糠醛和0.29 g/L酚類物質(zhì)。將玉米芯酶解液稀釋到還原糖質(zhì)量濃度為100 g/L，以此作為發(fā)酵初始糖濃度，在添加棉籽粕3.5 g/L，3 U/L的中性蛋白酶，10 mol/L NaOH控制pH 6.5情況下，當葡萄糖質(zhì)量濃度降到30 g/L左右時，通過補加濃縮的玉米芯水解液使得總還原糖質(zhì)量濃度為100 g/L左右(共補加含有大概550 g葡萄糖的濃縮液)，結(jié)果見圖3。

圖3 菌YBS1-5補料發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸Fig.3 D-Lactic acid production from strain YBS 1-5 by feed fermentation

由圖3可以看到，菌YBS1-5在90 h內(nèi)積累了111.8 g/L的D-乳酸，殘留7 g/L的葡萄糖，而由于菊糖芽孢乳桿菌本身缺少利用木糖的關(guān)鍵酶基因[19]，所以在整個發(fā)酵過程中木糖未被利用。發(fā)酵過程中平均生產(chǎn)速率、糖酸轉(zhuǎn)化率以及光學純度分別為1.24 g/(L·h)、87%和98%以上，光學純度見圖4。

這些數(shù)據(jù)表明：玉米芯酶解液中殘留的少量糠醛、5-羥甲基糠醛和酚類物質(zhì)及未脫棉酚的棉籽粕未對菌株YBS1-5產(chǎn)D-乳酸有明顯的抑制作用，菌株YBS1-5能夠有效地利用玉米芯水解液和棉籽粕做底物產(chǎn)D-乳酸。

地面坐標系是以接收機所在位置為坐標原點，正東方向為X軸正方向，Y軸為正北方向，Z軸鉛錘向上三者構(gòu)成的右手直角坐標系。機體坐標系原點為飛機中心(即雷達觀測目標)，如圖1所示，X軸正方向為平行于飛機機身軸線指向正前方，Z軸位于目標對稱平面內(nèi)，垂直于X軸指向飛機正上方，Y軸垂直于飛機對稱平面，方向符合右手法則。同時，在飛機直線飛行時，認為飛機速度方向即飛機機體坐標系X軸正方向。被動雷達的雷達視線包括從輻射源到目標和從目標到接收機，在本文中選用的輻射源為導航衛(wèi)星?？紤]到飛機目標在直線飛行時，左右機翼水平，側(cè)滾角始終為0°，為了簡化模型，在本文中只考慮方位角和俯仰角。

圖4 D-乳酸的光學純度Fig.4 Optical purity of D-lactic acid

3 結(jié)論

本研究采用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯酶解液和棉籽粕做為D-乳酸發(fā)酵的底物。在中性蛋白酶用量為3 U/L發(fā)酵液、棉籽粕3.5 g/L、初始還原糖質(zhì)量濃度為100 g/L的情況下，通過2次補加，菌YBS1-5在90 h內(nèi)產(chǎn)生了111.8 g/L的D-乳酸，轉(zhuǎn)化率為87%，光學純度達98%以上。本研究為經(jīng)濟有效利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)D-乳酸提供了一種新的方法。