霍光明，張李陽，朱枳穆，俞麗娜

(1.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇南京211171； 2.江蘇省高?！疤厥馍镔|廢棄物資源化利用”重點建設實驗室，江蘇南京211171)

纖維素酶在許多工業(yè)應用過程中都起著重要作用，已被用在食品加工、紙張回收、清潔生產(chǎn)和動物飼料添加劑等領域[1-2]。將木質纖維素轉化為大宗化學品是一項具有挑戰(zhàn)性的中心工作[3]。因此，尋找轉化效率高、穩(wěn)定性好、適應能力強且價格便宜的產(chǎn)纖維素酶菌株是研究熱點之一。

放線菌是一類具有降解纖維素能力的重要微生物，具有將纖維素轉化為可發(fā)酵糖的能力，可用于生產(chǎn)大宗化學品,受到研究者關注[4-5]。鏈霉菌是放線菌中數(shù)量最大、研究最多的一類菌。鏈霉菌屬中的許多種菌具有分解纖維素的能力，但一般分解纖維素能力較弱，且多為高溫放線菌；雖然有中溫放線菌對纖維素分解的報道，但大多仍屬形態(tài)學、生態(tài)學方面的觀察[1]。

本研究報道了1株來源于南京方山鞭蝎Typopeltiscrucifer腸道的鏈霉菌Streptomycessp.S10A09，具有較強的分解纖維素的能力，采用軟件Minitab 15中的Plackett-Burman(PB)設計法、CCD中心組合設計法和響應面分析方法(RSM)對Streptomycessp.S10A09進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，以期為纖維素酶的生產(chǎn)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源

從Typopeltiscrucifer腸道中分離獲得的能降解纖維素的菌株Streptomycessp.S10A09，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保存編號為CCTCC M 2014462。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基(羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養(yǎng)基)(g/L)：CMC-Na 10、NH4NO31.0、酵母膏1.0、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO41.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)： CMC-Na 10、(NH4)2SO44、KH2PO42、MgSO40.3、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.2、ZnSO40.002、MnCl20.002、CoCl20.002。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株液體發(fā)酵

將初篩到的菌株活化后接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 ℃、搖床轉速150 r/min的條件下培養(yǎng)4 d。種子液以體積分數(shù)10%接種量轉接于裝有100 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的體積250 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)4 d。

1.2.2 粗酶液的制備

將發(fā)酵培養(yǎng)液于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液測定酶活。

1.2.3 纖維素酶活力的測定(DNS法)

1)總酶活(濾紙酶活力(FPA))測定。參照文獻[7]并稍作修改。取稀釋10倍后的粗酶液0.5 mL，加入1.0 mL 0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液(pH 4.8)和50 mg新華濾紙，以不加底物為對照，50 ℃反應60 min，加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測540 nm處的OD540值。

2)纖維素內切酶(羧甲基纖維素酶)活力測定。參照文獻[8]并稍作修改。取稀釋10倍后的粗酶液0.5 mL，加入1.0 mL、pH 4.8的1%CMC-Na溶液，對照管中不加底物，50 ℃反應30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測540 nm處的OD540值。

3)纖維素外切酶(微晶纖維素酶)活力測定。參照文獻[9-11]并稍作修改。取0.5 mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0 mL、1%的微晶纖維素溶液(pH 4.8)，以不加底物為對照，50 ℃反應60 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測540 nm處的OD540值。

4)β-葡萄糖苷酶活力測定。參照文獻[12]并稍作修改。取0.5 mL稀釋3倍后的酶液，加入1.0 mL、1%的水楊苷溶液(pH 4.8)，以不加底物為對照，50 ℃反應30 min，加入3 mL DNS溶液，沸水浴5 min，再將試管置于冷水浴中，待試管冷卻后，加入18 mL蒸餾水。以空白管做對照，采用分光光度計測540 nm處的OD540值。

5)FPA酶活力計算方法。酶活力定義：在pH 4.8、50 ℃條件下，每1 mL酶液在1 min內水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量稱作一個酶活力單位(U)。

纖維素酶活力=1 000Gn/(0.5t)

(1)

式中：G為所測得的OD540值在葡萄糖標準曲線上查出的還原糖質量濃度(mg/mL)，n為酶液的稀釋倍數(shù)，1 000為毫克換算成微克，0.5為反應酶液的體積(mL)，t為酶和底物反應時間(min)。

1.2.4 菌株產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

1)碳源對產(chǎn)酶的影響。在基礎培養(yǎng)基的基礎上，通過單因素實驗，確定產(chǎn)纖維素酶的最佳碳源。分別以CMC-Na 10 g、葡萄糖5 g、玉米漿10 g、蔗糖5 g、甘油5 g、甲殼素5 g以及黃芪藥渣粉10 g為碳源。生長好的種子液按照體積分數(shù)10%的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液在5 500 r/min下離心10 min，上清液即為粗酶液，測定其FPA。通過FPA確定最佳碳源。

2)氮源對產(chǎn)酶的影響。在確定最佳碳源的基礎上，用不同的氮源代替發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4，選擇的氮源有(NH4)2SO4、麩皮、蛋白胨、酵母膏和黃豆粉共5種氮源，將種子液以體積分數(shù)10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液5 500 r/min離心10 min，得到的上清液即為粗酶液。通過測定FPA確定最佳氮源。

3)金屬離子對放線菌產(chǎn)酶活性的影響。在碳氮源相同的情況下，選擇7種金屬離子進行篩選，研究對纖維素酶活力有影響的金屬離子，見表1。

4)Plackett-Burman 實驗設計和CCD中心組合設計。利用Minitab 15軟件[13]，實驗中選用N=12的 PB 設計，把每個因素設計成高(+1) 和低(-1) 2 個水平。然后根據(jù)PB實驗篩選出的對纖維素酶活具有顯著影響的因素，采用CCD中心組合設計方法進行實驗條件優(yōu)化，建立回歸方程并進行響應面分析。

表1 對纖維素酶活力影響的7種金屬離子

注：“+”表示含有該培養(yǎng)基成分；“—”表示未添加該培養(yǎng)基成分。

5)驗證試驗。根據(jù)PB和CCD實驗建立的模型的最佳發(fā)酵條件進行驗證實驗，所有實驗重復3次，測定FPA作為驗證指標。

2 結果與討論

2.1 碳源對產(chǎn)酶的影響

纖維素酶是一種誘導酶，因此纖維素既可以作為碳源來源，又可以作為主要誘導物。通過單因素實驗篩選了7種不同的碳源進行發(fā)酵，結果見表2。

由表2可知，CMC-Na和葡萄糖作為碳源，產(chǎn)生的總酶活(FPA)最高可達43 U/mL以上。由于CMC-Na價格低于葡萄糖，且產(chǎn)生生物量大，綜合考慮選擇CMC-Na為碳源。

表2 碳源對產(chǎn)酶的影響

2.2 氮源對產(chǎn)酶的影響

在基礎培養(yǎng)基基礎上，通過單因素實驗篩選5種類型的氮源進行發(fā)酵，測定不同氮源對產(chǎn)酶的影響，結果如表3所示。

由表3可以發(fā)現(xiàn)，以(NH4)2SO4組成的無機氮源發(fā)酵后產(chǎn)生的總酶活FPA最高，明顯高于有機氮源的培養(yǎng)基。故選擇(NH4)2SO4作為氮源。

2.3 金屬離子對產(chǎn)酶的影響

通過單因素實驗篩選不同類型的金屬離子進行發(fā)酵試驗，測定不同金屬離子對產(chǎn)纖維素酶活力的影響，結果見表4。

由表4可知，Zn2+和Ca2+對產(chǎn)纖維素酶有抑制作用[16]，而K+和Fe3+缺少會降低酶活。

2.4 PB實驗設計篩選重要因素

運用PB實驗設計的方法，快速篩選出培養(yǎng)基不同類型成分中對放線菌Streptomycessp.S10A09 產(chǎn)纖維素酶影響的顯著因素，PB實驗結果和主效應分析見表5和表6。

表3 氮源對產(chǎn)酶的影響

表4 金屬離子對產(chǎn)酶的影響

注：+表示含有該培養(yǎng)基成分；—表示未添加該培養(yǎng)基成分。

表5 Plackett-Burman試驗結果

注：X1～X8分別代表CMC-Na、(NH4)2SO4、KH2PO4、FeSO4、NaCl、InSO4和CaCO3的質量濃度(g/L)。

由表5～6可知：影響Streptomycessp.S10A09產(chǎn)纖維素酶活的2個顯著因素為X1和X2(P<0.05)，即CMC-Na和(NH4)2SO4質量濃度。采用2因素3水平的CCD試驗尋找產(chǎn)酶條件的最佳組合。R2=95.41%，R2(調整)=83.18%，說明PB實驗擬合度較高。

2.5 中心組合試驗

2.5.1 CCD中心組合試驗

根據(jù)PB設計實驗篩選出對纖維素酶活具有顯著影響的因素，采用中心組合設計方法進行實驗條件的優(yōu)化，實驗平行3次，結果取平均值。實驗設計和數(shù)據(jù)分析使用軟件Minitab 15.0。中心組合實驗變量水平及結果如表7所示。

表6 Plackett-Burman試驗因素水平及其主效應分析

注：T為檢驗統(tǒng)計量；P值為檢驗P值，若P值小于5%，駁回歸屬假設。

表7 中心組合試驗變量水平及結果

由表9可以看出，回歸的整體、一次項、二次項P值均小于0.05，說明都顯著有效；而交叉乘積項則不顯著。失擬(Lack-of-Fit)值為0.10(大于0.05)，表示二次多項式回歸模型正確。R2=97.33%，說明二次多項式回歸效果非常好。

表8 濾紙酶活的估計回歸系數(shù)

表9 濾紙酶活的方差分析

圖1和2為依據(jù)回歸方程繪出的響應面圖。響應面代表著兩個獨立變量之間的相互作用。

由圖1和2可見：CMC-Na(X1)對濾紙酶FPA活力的影響極其顯著，表現(xiàn)為較陡的曲面；(NH4)2SO4(X2)對FPA活力影響較小，曲面較平滑。

圖1 濾紙酶響應面圖Fig.1 Response surface figure of filter paper activity

圖2 濾紙酶響應面圖及等高線圖Fig.2 Response surface figure and contour map of filter paper activity

2.5.2 優(yōu)化結果驗證

根據(jù)模型預測，產(chǎn)酶最優(yōu)條件為：X1=0.128 565(2.57 g/ L)，X2=1.414 210(11.31 g/L)，此時，預測的FPA最大響應值為126.54 U/mL。為了進一步確證模型預測的準確性，在優(yōu)化的理論最佳條件下進行驗證試驗，所得FPA為125.96 U/mL，可見該模型能較好地預測實際發(fā)酵情況。且Strptomycessp.S10A09 產(chǎn)纖維素酶FPA接近優(yōu)化前的3倍，高于已報道的Streptomycesruber、Streptomycesnoboritoensis等菌產(chǎn)纖維素酶的活性[14-16]。

3 結論

利用PB單因素、中心組合設計與響應面結合的方法，借助Minitab軟件分析，對放線菌Strptomycessp.S10A09 產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件進行研究并得到優(yōu)化結果，最終確定Strptomycessp.S10A09液體發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)為CMC-Na 2.57、(NH4)2SO411.31、KH2PO40.2、MgSO41、FeSO40.01。優(yōu)化后，F(xiàn)PA達到125.96 U/mL，接近優(yōu)化前的3倍。Strptomycessp.S10A09具有培養(yǎng)基簡單、可利用無機氮源以及活性較高等特點，有利于工業(yè)化應用。在進一步研究中，將對其纖維素酶蛋白進行純化，為進一步應用奠定基礎。