張 煒，吳正云*，羅 力，羅愛民，張文學

（1.四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.古藺力苑農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責任公司，四川 瀘州 646500）

李果實成熟期一般在7、8月份，采后極易遭到微生物侵染而腐敗，造成經(jīng)濟損失。已有研究表明，引起李果實腐敗變質的微生物包括褐腐病菌（Monilinia fructicola）、酵母菌（Saccharomycetes）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等，其中褐腐病菌是最主要的致腐真菌[1-3]。目前主要使用人工合成的化學殺菌劑來控制李果實采后的微生物侵染（如撲海因、特克多、仲丁胺等），但這些化學合成物質殘留量較大，長期攝入過多后會對人體產(chǎn)生危害[4-5]，因此尋找更加安全、有效的控制李果實采后病害的方法十分迫切。近年來很多研究證實了天然植物抑菌成分對果蔬貯藏保鮮的效果[6-9]，吳振宇等[10]研究了黃連等四種植物提取物對桃褐腐病的抑制作用，得出黃柏和黃連以1∶7復配增效作用最顯著。艾啟俊[11]研究發(fā)現(xiàn)，鹿蹄草提取液對根霉、黑曲霉、青霉有明顯抑制作用，在蘋果貯藏防腐方面有良好效果。本研究通過離體抑菌實驗，從甘草、肉桂、丁香、高良姜、小茴香、八角、肉豆蔻七種植物原料中篩選出能有效抑制褐腐病菌（Monilinia fructicola）、酵母菌（Saccharomycetes）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）生長的植物原料，將抑菌效果較好的甘草、肉桂提取液聯(lián)合使用，研究其對褐腐病菌的抑制效果，并通過生化檢測探究這兩種提取液對褐腐病菌的抑菌機理，為天然防腐劑的進一步研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

肉桂、丁香、高良姜、甘草、小茴香、八角、肉豆蔻：四川省成都市武侯區(qū)華安堂藥業(yè)零售連鎖有限公司；褐腐病菌（Monilinia fructicola）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）；黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酵母菌（Saccharomycetes）：四川大學生態(tài)食品工程與生物技術研究室保藏。

1.1.2 化學試劑

牛血清蛋白標準品（純度≥98%）：上海藍季科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍G250、無水葡萄糖、瓊脂、酵母膏、蛋白胨：成都市科龍試劑有限公司。實驗所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，無水葡萄糖2%，瓊脂1.5%～2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母膏1%，無水葡萄糖2%，瓊脂1.5%～2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

JSP-250高速多功能粉碎機：浙江省永康市金穗機械制造廠；RE52-1旋轉蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；SpectraMax-90酶標儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS低速離心機：湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；DDS-307電導率儀：上海越平科學儀器有限公司；UV-1600型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

褐腐病菌、黑曲霉和米曲霉在無菌條件下，用PDA培養(yǎng)基斜面活化，置于28℃條件下培養(yǎng)2～3 d，用生理鹽水洗下，制成105CFU/mL的單孢子懸液，低溫保存?zhèn)溆?。酵母菌在無菌操作下從YEPD培養(yǎng)基斜面中取出，接種到裝有液體YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28℃條件下培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)液在4000r/min條件下離心10min，用生理鹽水洗滌2次，棄去上清液，加入生理鹽水制成105CFU/mL菌懸液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 植物提取液制備

將七種植物原料分別粉碎后過40目篩（孔徑0.37mm），分別稱取10.0 g，裝入有磨口塞的三角燒瓶中，加入50 mL體積分數(shù)為80%的乙醇，浸泡48 h，超聲30 min后抽濾；收集濾液后重復上述過程再提取1次，合并濾液將濾液旋轉蒸發(fā)濃縮至10 mL，即得到七種植物提取液原液，置于常溫避光條件下，密封保存，備用。

1.3.3 植物提取液抑菌圈測定

采用濾紙片法[11]測定抑菌圈直徑（濾紙片直徑6 mm）。抑菌效果判斷標準[12]：抑菌圈直徑＞15 mm就表明該微生物對抑菌劑高度敏感、10～15 mm為中度敏感、6～10 mm為低度敏感、＜6 mm則為不敏感。

1.3.4 植物提取液最低抑菌濃度測定

采用倍比稀釋法[13]測定最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）。用酶標儀測定菌液OD600nm值。培養(yǎng)前后的OD600nm值未發(fā)生變化即表示供試微生物在此條件下沒有生長，此時的濃度即為該植物提取液的MIC。一般認為MIC≤62.5 mg/mL時抑菌效果較好，MIC≥125 mg/mL時抑菌效果較差[14]。

1.3.5 甘草、肉桂復配提取液抑菌效果評價

采用微量棋盤稀釋法[15]將甘草、肉桂提取液進行復配，測定復配提取液的抑菌效果。甘草和肉桂復配提取液的抑菌效果可用分級抑制濃度（fractional inhibitory concen tration，F(xiàn)IC）指數(shù)加以評價。FIC指數(shù)=MIC復合A/MIC單一A+MIC復合B/MIC單一B。FIC指數(shù)判斷標準：FIC指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FIC指數(shù)≤1.0，相加作用；1.0＜FIC 指數(shù)＜4.0，無相關作用；FIC指數(shù)≥4.0，拮抗作用。

1.3.6 甘草、肉桂提取液對褐腐病菌抑菌機理研究

甘草、肉桂提取液對褐腐病菌菌液電導率及對褐腐病菌菌液可溶性蛋白質的影響分別參照文獻[16-17]的方法測定。

2 結果與分析

2.1 提取液對四種致腐真菌的抑菌圈直徑

質量濃度為1.0 g/mL和0.5 g/mL的植物提取液對四種致腐真菌抑菌圈直徑測定結果見表1。由表1可知，質量濃度為1.0 g/mL和0.5 g/mL的甘草提取液對褐腐病菌抑菌作用最強，其抑菌圈直徑為12.03 mm、11.33 mm，抑菌效果為中度敏感，而對其他三種真菌（酵母菌、米曲霉及黑曲霉）無抑菌效果。肉桂提取液對酵母菌、米曲霉、黑曲霉三種供試菌抑菌作用最強，質量濃度為1.0 g/mL和0.5 g/mL的肉桂提取液對其抑菌圈直徑分別為21.25mm、10.19mm，13.28mm、10.79 mm，17.49 mm、15.62 mm，抑菌效果為中高度敏感。其他植物提取液對上述四種致腐真菌的抑菌效果相對較弱，其抑菌圈直徑維持在6～12 mm。

表1 七種藥食兩用植物提取液對四種致腐真菌的抑菌圈測定結果Table1 Determination results of the inhibition zone of seven kinds of medicinal and edible plants extracts on four kinds of rot-causing fungi

2.2 提取液對四種致腐真菌的MIC

植物提取液對四種致腐真菌的MIC測定結果見表2。由表2可知，七種植物提取液對褐腐病菌、黑曲霉的MIC≤62.5mg/mL，抑菌效果好；肉桂、丁香、八角茴香提取液對酵母菌的MIC值分別為15.63mg/mL、31.25mg/mL、62.50mg/mL，抑制作用強；八角茴香提取液對米曲霉的MIC值為31.25mg/mL，抑菌效果好。

表2 七種藥食兩用植物提取液對四種致腐真菌的MIC測定結果Table2 Determination results of the MIC of seven kinds of medicinal and edible plants extracts on four kinds of rot-causing fungi

綜合來看，對褐腐病菌抑制作用最強的是甘草提取液，MIC值為7.81 mg/mL，1.0 mg/mL甘草提取液抑菌圈直徑為12.03 mm。對酵母菌、米曲霉、黑曲霉抑制作用最強的是肉桂提取液，MIC值分別為15.63 mg/mL、125.00 mg/mL、31.25 mg/mL，1.0 mg/mL肉桂提取液抑菌圈直徑分別為21.25 mm、13.28 mm、17.49 mm；但其對褐腐病菌的MIC值為15.63 mg/mL，抑菌圈直徑為8.83 mm，抑制效果弱于甘草提取液。

2.3 甘草、肉桂復配提取液對褐腐病菌的抑菌效果

甘草和肉桂復配提取液對褐腐病菌的聯(lián)合抑菌效果見表3。由表3可知，在1/2MIC甘草提取液與1/4MIC肉桂提取液聯(lián)合作用下，對褐腐病菌的抑制作用明顯。此時FIC指數(shù)為0.75，抑菌效果增強。

表3 甘草和肉桂復配提取液對褐腐病菌聯(lián)合抑菌效果Table3 Antibacterial effects of compound extracts of licorice and cinnamon onMonilinia fructicola

2.4 甘草和肉桂提取液對褐腐病菌抑制作用機理的探討

植物提取液主要通過破壞酵母菌、米曲霉、黑曲霉等真菌細胞膜結構，改變細胞膜滲透性從而發(fā)揮抑菌作用[18]，但其對褐腐病菌抑制作用機理的報道不多。選擇褐腐病菌為研究對象，進一步研究甘草、肉桂提取液對其的抑制作用機理。甘草和肉桂提取液對褐腐病菌菌液相對電導率和可溶性蛋白質含量影響結果見圖1。

圖1 甘草、肉桂提取液處理下褐腐病菌菌液相對電導率（A）和可溶性蛋白質含量（B）的變化Fig.1 Changes of relative conductivity(A)and soluble protein content(B)ofMonilinia fructicolasolution treated with licorice and cinnamon extracts

從圖1A可知，甘草、肉桂提取液處理0～30 min，菌液相對電導率迅速升高，并在30 min時達到峰值，分別為96.64%、48.47%，此后基本保持不變。在整個時間段，對照組相對電導率變化幅度很小，保持在6%左右。由圖1B可知，可溶性蛋白質含量變化趨勢與電導率變化趨勢一致，在整個時間段，對照組可溶性蛋白質含量維持在6.0 μg/mL左右，而甘草、肉桂處理組可溶性蛋白質含量在30min時達到最大值，分別為50.6μg/mL、25.1μg/mL，此后基本保持不變。細胞正常代謝必須依靠一個完整的細胞膜結構。當細胞膜遭到破壞時，其滲透性發(fā)生改變，細胞內(nèi)部電解質大量外泄至細胞外，導致培養(yǎng)液電導率上升，鑲嵌在細胞膜上的蛋白質泄露到細胞外，使培養(yǎng)液蛋白質含量增加[19]。由圖1推測甘草、肉桂提取液處理破壞了菌體細胞膜結構，導致細胞質外滲，可溶性蛋白質含量上升。已有研究[20-21]顯示，甘草、肉桂提取液發(fā)揮抑菌作用主要是通過改變細胞膜滲透性及破壞細胞膜結構得以實現(xiàn)，與本研究得出的結論相似。在本研究中，甘草對褐腐病菌抑制效果明顯強于肉桂，推測是由于兩種植物提取液在細胞膜上抑菌作用位點不同，從而導致抑菌效果出現(xiàn)差異。

3 結論

本研究以褐腐病菌、酵母菌、黑曲霉、米曲霉為供試菌，通過體外抑菌試驗研究了甘草、肉桂、丁香等七種植物提取液的抑菌效果。結果表明，1.0 g/mL甘草提取液對褐腐病菌有較強的抑制效果，抑菌圈為12.03 mm；1.0 g/mL肉桂提取液對酵母菌、黑曲霉、米曲霉有較強的抑制效果，抑菌圈直徑分別達到21.25 mm、17.49 mm、13.28 mm。1/2MIC甘草提取液與1/4MIC肉桂提取液聯(lián)合使用時，對褐腐病菌的FIC指數(shù)為0.75，表現(xiàn)為相加作用。甘草、肉桂提取液處理后腐病菌培養(yǎng)液相對電導率分別為96.64%、48.47%，可溶性蛋白質含量增加至50.6 μg/mL、25.1 μg/mL，提示其抑菌機制可能是通過破壞細胞膜結構從而導致褐腐病菌死亡。