何宏魁，袁 木，蔡照潤，曹潤潔，李安軍，張治洲*

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州 236800；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209）

在白酒釀造領(lǐng)域，一般認(rèn)為甲烷菌利用氫氣（H2）還原二氧化碳（CO2）產(chǎn)生甲烷（CH4），使菌群代謝平衡向促進(jìn)有機(jī)酸、酒精生成的方向轉(zhuǎn)化，提高了酒醅中的酸和酯的含量，也提高了產(chǎn)酒率[1-2]。根據(jù)“種間氫轉(zhuǎn)移”原理，甲烷菌屬利用己酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的H2用于產(chǎn)生甲烷，使己酸菌消除了氫的抑制而促進(jìn)產(chǎn)酸，繼而提高己酸乙酯含量。但是上述過程只能在窖池的有限的位置發(fā)生，因?yàn)橹挥幸欢ㄉ疃葪l件下的窖池底部密封發(fā)酵一段時(shí)間以后才可能滿足甲烷菌屬的厭氧生長條件。甲烷菌促進(jìn)白酒發(fā)酵質(zhì)量的途徑肯定是多方面的，理論上不同的甲烷菌屬在窖泥-黃水-酒醅界面的厭氧發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用與方式會(huì)有所不同。但是這些甲烷菌屬到底通過哪些生物學(xué)途徑發(fā)揮作用、甲烷菌屬之間存在哪些重要的相互作用等問題還需要大量的研究[1，3-4]才能逐步搞清楚，需要檢測(cè)各個(gè)甲烷菌屬在發(fā)酵動(dòng)力過程中的含量變化。所以設(shè)計(jì)一批針對(duì)各個(gè)甲烷菌屬的屬或種的特異性引物很有必要。

張會(huì)敏[5]的高通量測(cè)序結(jié)果顯示，古井貢酒窖泥包含的甲烷菌屬至少有甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）（1-458），未知甲烷菌-1（unkown genus-1）（1-2），未知甲烷菌-2（unkown genus-2）（2-8），產(chǎn)甲烷袋菌屬（Methanofollis）（3-896），甲烷囊菌屬（Methanoculleus）（16-14155），甲烷粒菌（Methanocorpusculum）（6-2180），甲烷球菌屬（Methanoc-occus）（2-10），甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）（3-903）以及甲烷桿菌屬（Methanobacterium）（5-1514），括號(hào)里面的兩個(gè)數(shù)字分別是各自操作分類單元（operational taxonomy unit，OTU）的個(gè)數(shù)及其序列總個(gè)數(shù)，顯示古井貢酒窖泥中甲烷囊菌屬（Methanoculleus）這個(gè)屬的序列復(fù)雜度及菌屬含量在全部甲烷菌中相對(duì)較大。在窖泥質(zhì)量評(píng)估的方法體系中，甲烷菌屬的屬特異性檢測(cè)方法屬于重要的建設(shè)內(nèi)容。

甲烷菌屬在濃香型白酒窖泥中的含量分布情況比較類似，既有的檢測(cè)報(bào)道一般是3～6個(gè)屬。如五糧液酒的窖泥中報(bào)道了4個(gè)優(yōu)勢(shì)甲烷菌屬，分別為甲烷細(xì)菌屬（Methanobacterium）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）和甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina），其中Methanosarcina可同時(shí)利用乙酸和氫氣[6]。四川綿陽豐谷酒業(yè)的窖泥中至少含有5個(gè)甲烷菌屬，分別是Methanoculleus、Methanosarcina、Methanobacterium、甲烷粒菌屬（Methanocorpusculum）和甲烷微菌屬（Methanomicrobium）[7-8]。四川瀘州某公司白酒生產(chǎn)窖池中發(fā)現(xiàn)至少有6個(gè)甲烷菌屬，分別是Methanobrevibacter、甲烷鬃毛菌屬（Methanosata）、Methanoculleus、Methanobacterium、Methanocorpusculum和甲烷絲菌屬（Methanothri）[9]，而瀘州老窖的百年窖泥中至少含有4類不同的甲烷菌屬，分別是甲烷短桿菌屬M(fèi)ethanobrevibacter、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、甲烷鬃菌屬（Methanosaeta）和Methanoculleus[10]。顯然，不同的濃香型白酒在日常質(zhì)控過程中需要對(duì)不同組合的甲烷菌屬設(shè)計(jì)特異性（快速）檢測(cè)技術(shù)。

甲烷菌的特異性檢測(cè)已經(jīng)有不少報(bào)道，韋艷霞等[11]研究根管感染中產(chǎn)甲烷古細(xì)菌的多樣性，利用甲基輔酶M還原酶（methylcoenzymeMreductase，MCR）基因α亞基（mcrA）的特異性引物，發(fā)現(xiàn)所選樣本中產(chǎn)甲烷古細(xì)菌的多樣性局限于類口腔甲烷短桿菌序列型。華金玲等[12]也是利用MCR基因特異性基因引物發(fā)現(xiàn)黃淮白山羊瘤胃中的甲烷菌主要是瘤胃甲酸甲烷桿菌。蘭阿峰等[13]利用甲烷菌16S rDNA特異性引物Met86F和Met1340R測(cè)定了野生秦嶺羚牛瘤胃中甲烷菌種類，發(fā)現(xiàn)至少包括3個(gè)科，若干個(gè)屬，其多樣性比較豐富。

利用MCR等基因設(shè)計(jì)的甲烷菌特異性引物，以及利用甲烷菌16SrDNA特異性引物的檢測(cè)方法，理論上適合于大多數(shù)產(chǎn)甲烷菌，但是難以把不同的甲烷菌種屬區(qū)分開來。在白酒研究領(lǐng)域也有若干甲烷菌特異性檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道，比如羅青春等[14]運(yùn)用已知特異性引物[15-17]和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）測(cè)定了不同年份川酒窖泥中幾種主要產(chǎn)甲烷菌的含量，發(fā)現(xiàn)隨著窖泥年份的增加，3種產(chǎn)甲烷菌屬甲烷鬃毛菌屬（Methanosaeta）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）及甲烷桿菌屬（Methanobacter）的含量均呈不同幅度的增加趨勢(shì)。不過對(duì)這些已知特異性引物的原始文獻(xiàn)進(jìn)行勘察時(shí)發(fā)現(xiàn)它們是目（order）分類層面上的特異性引物，而且并未交待引物特異性的基本驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

本研究以甲烷囊菌屬為例提供了一個(gè)基于16S rDNA的屬特異性單核苷酸多態(tài)性（single nucleic polymorphism，SNP）和半隨機(jī)引物（semi-arbitrarily primer，SAP）技術(shù)[18-20]設(shè)計(jì)屬特異性PCR引物的方法。利用本研究的方法原則上可以設(shè)計(jì)任意其他菌屬在特定復(fù)雜菌群背景下的特異性引物，一般應(yīng)該都可以找到比較滿意的實(shí)用引物，這對(duì)于白酒釀造過程中的質(zhì)量控制有明顯的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 窖泥樣本

共使用了18個(gè)古井窖泥樣本，包括A廠區(qū)6個(gè)（40年優(yōu)質(zhì)窖池，樣本1～6），B廠區(qū)3個(gè)（百年優(yōu)質(zhì)窖池，樣本7～9），C廠區(qū)9個(gè)（5年普通窖池，樣本10～18）。

1.1.2 試劑

NPK02和NPK62 PCR試劑盒：威海曉東生物技術(shù)有限公司；Ezup柱式基因組提取試劑盒、Marker D：上海生工生物有限公司；特異性引物：上海生工生物有限公司合成；其他生化試劑均購自上海生工生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-60B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亨科學(xué)儀器廠；TP600 PCR儀：大連TaKaRa公司；StepOne實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-QPCR）儀：美國ABI公司；JY300C核酸電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；WD-9413C凝膠成像儀：北京市六一儀器廠；HC-3108R（-80℃）低溫冰箱：海爾集團(tuán)公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥宏基因組的提取

利用Ezup柱式基因組提取試劑盒提取窖泥的宏基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA），來自200mg的窖泥的基因組DNA溶于100 μL TE緩沖液，再進(jìn)一步稀釋至500 μL作為PCR或RT-QPCR的模板，RT-QPCR測(cè)定的是500 μL該溶液中甲烷囊菌屬16S rDNA的拷貝數(shù)濃度。

1.3.2 16S rRNA序列比對(duì)分析及甲烷囊菌屬SNP位點(diǎn)確認(rèn)

古井窖泥微生物菌群中含量最高的30個(gè)屬及甲烷囊菌屬的16S rRNA全長序列源自于高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)[21]；傅里葉轉(zhuǎn)換多重序列比對(duì)（multiple alignment using fast Fourier transform，MAFFT）的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是其比對(duì)結(jié)果中序列越相近則排列距離越接近，這樣可以對(duì)幾百條到幾千條高度相似的序列快速進(jìn)行分組，非常有利于大量序列中SNP位點(diǎn)的尋找。使用MAFFT對(duì)上述總共5 000多條序列和從Genbank數(shù)據(jù)庫搜索得到的210條甲烷囊菌屬（Methanoculleus）的16S rRNA（有些是全長）基因序列進(jìn)行比對(duì)，選出各自的代表性序列，以進(jìn)行各屬之間的SNP識(shí)別分析。SNP標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記，在分子遺傳學(xué)、藥物遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)以及疾病的診斷和治療等方面發(fā)揮著重要作用[22-26]。借助MAFFT多序列比對(duì)工具對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)尋找SNP位點(diǎn)，對(duì)列出的所有SNP位點(diǎn)，返回甲烷囊菌屬內(nèi)與自身其余序列進(jìn)行SNP查證，要求該位點(diǎn)堿基與其余序列該位置堿基絕大部分相同；再與古井菌群各屬其余序列比對(duì)查證，要求與該位置堿基絕大部分不同，從而選出理論上效果最好的SNP位點(diǎn)。

1.3.3 甲烷囊菌屬特異性引物設(shè)計(jì)

PCR引物的堿基長度需在20～25 bp之間，退火溫度需在60℃左右，堿基GC含量應(yīng)在40%～60%，以此保持引物的穩(wěn)定性。根據(jù)SAP理論的一般設(shè)計(jì)方法，引物的3′端的末端應(yīng)該是SNP位點(diǎn)，在SNP位點(diǎn)的前一位點(diǎn)（引物的倒數(shù)第二位）人為的引入錯(cuò)配，以致于引物與靶序列（甲烷囊菌屬）只有在倒數(shù)第二位有錯(cuò)配，而與非靶序列在最后兩個(gè)堿基位點(diǎn)都是錯(cuò)配。因此，可以通過合適的擴(kuò)增條件使得非靶序列不能得到有效的擴(kuò)增。本研究基于該理論在錯(cuò)配的位置做了稍許調(diào)整，SNP位點(diǎn)只需要放置在引物3′端的末位，不一定是最后一位，可以是倒數(shù)第二位；錯(cuò)配位置也放在末位，不一定是倒數(shù)第二位也可以是倒數(shù)第三位附近，宗旨是讓引物與靶序列在引物的3′端末端幾個(gè)堿基的配對(duì)強(qiáng)度大于非靶序列，在這方面實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)做了若干摸索實(shí)驗(yàn)[18]。引物的特異性經(jīng)過PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證，確定特異性無誤的引物可以進(jìn)一步用于RT-QPCR再驗(yàn)證。

1.3.4 引物特異性檢測(cè)

利用PCR對(duì)兩對(duì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證。18個(gè)窖泥基因組DNA等量混合，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：NPK02 2×buffer 6 μL，物種特異性引物1.5 μL，模板1 μL，Taq酶0.3 μL，雙蒸水（ddH2O）3.2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，37個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸2 min。取8 μL反應(yīng)液進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.5 RT-QPCR定量

要求RT-QPCR的熔解曲線為單峰且沒有明顯的二聚體擴(kuò)增。以設(shè)計(jì)好的兩對(duì)甲烷囊菌屬特異性引物PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物作為RT-QPCR定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其母液（質(zhì)量濃度為ng/μL）經(jīng)10倍系列稀釋（10-1～10-）7，后，選擇10-2～10-7的稀釋液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。摸索到的最佳RT-QPCR條件為：第1對(duì)引物RT-QPCR擴(kuò)增程序：95℃、4min；95℃、30s，60℃、30s，72℃、5s，42個(gè)循環(huán)；72℃、2min。第2對(duì)引物QPCR擴(kuò)增程序：95℃、4 min；95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、55 s，42個(gè)循環(huán)；72℃、2 min。2對(duì)引物RT-QPCR擴(kuò)增體系：NPK62 2×Buffer 6 μL，上下游引物（2 μmol/L）各1.75 μL，窖泥宏基因組DNA模板4 μL，Taq酶0.25 μL。每對(duì)引物在最佳條件下重復(fù)擴(kuò)增3次，選擇其中一個(gè)最具代表性的結(jié)果繪圖和計(jì)算。

DNA拷貝量計(jì)算公式如下：

式中：C為測(cè)定得到的各個(gè)樣本中甲烷囊菌屬DNA片段的濃度，ng/μL；L為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長度，bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP位點(diǎn)選取及引物設(shè)計(jì)

通過使用傅里葉轉(zhuǎn)換多序列比對(duì)在線多序列比對(duì)工具，分析了甲烷囊菌屬在古井窖泥中含量前30屬中的SNP情況，通過各屬自身的序列比對(duì)，挑選出各屬的代表序列，如表1所示。

表1 屬代表序列選取結(jié)果Table1 Selection results of genus-representative sequence

由表1可知，古井菌群30個(gè)屬，每個(gè)屬2條代表序列，共60條；甲烷囊菌屬代表序列1條；對(duì)61條序列進(jìn)行比對(duì)，初步找出了甲烷囊菌的114個(gè)SNP位點(diǎn)。首先對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行甲烷囊菌屬內(nèi)可行性驗(yàn)證，保留了41個(gè)SNP位點(diǎn)；然后對(duì)41個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行屬外可行性驗(yàn)證，與古井菌群30個(gè)屬所有序列（共計(jì)5 499條）比對(duì)驗(yàn)證后，找出了3個(gè)效果最好的SNP位點(diǎn)，SNP位點(diǎn)5′-TCCAGGCCC-3′的同屬代表性是94.3%，他屬代表性是0.4%；位點(diǎn)5′-AAAACTTT-3′的同屬代表性是94.8%，他屬代表性是0.8%；位點(diǎn)5′-TTCGACAGT-3′的同屬代表性是94.8%，他屬代表性是0.4%。隨機(jī)選擇SNP位點(diǎn)5′-TTCGACAGT-3′設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其信息見表2。

表2 兩對(duì)引物信息Table2 Information of two pairs of primers

2.2 引物特異性的驗(yàn)證

以18個(gè)窖泥樣本的混合宏基因組DNA[19]為模板，采用設(shè)計(jì)好的兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。由表2可知，兩對(duì)引物的預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小分別為595 bp和419 bp；而圖1顯示的電泳條帶大小與預(yù)測(cè)值相一致，表明這兩對(duì)引物能夠擴(kuò)增出預(yù)計(jì)的核酸序列，滿足特異性的基本要求。擴(kuò)增產(chǎn)物需要測(cè)序來進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增特異性。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。分別使用引物Met1-f和Met2-f進(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見表3。測(cè)序所得的堿基長度分別為545bp和357 bp?？紤]到引物測(cè)序一般從引物位置后面30～50個(gè)堿基處才能開始得到可讀序列，實(shí)際的PCR產(chǎn)物大小需要在545bp和357bp基礎(chǔ)上再加上30～50個(gè)堿基，這樣就完全符合595 bp和419 bp的預(yù)期大小。將表3序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中進(jìn)行BLAST驗(yàn)證，確認(rèn)其均為甲烷囊菌目標(biāo)序列。

圖1 兩對(duì)引物特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Verification results of specificity of two pairs of primers

表3 PCR產(chǎn)物單向測(cè)序結(jié)果Table3 PCR product sequencing results using forward primers

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

RT-QPCR的熔解曲線是衡量引物特異性的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究預(yù)期的熔解曲線是一個(gè)主峰下有很多熔點(diǎn)非常接近的次峰。這是因?yàn)閿U(kuò)增出來的是一組大小和熔點(diǎn)都非常接近的DNA片段。兩對(duì)引物的熔解曲線見圖2，RT-QPCR定量計(jì)算結(jié)果見圖3。由圖2可知，Met1為引物的熔解曲線中含有少量（Tm）值有明顯偏差的小峰；雖然對(duì)定量結(jié)果影響不大，但是值得在應(yīng)用過程中加以關(guān)注和繼續(xù)評(píng)估。由圖3可知，兩對(duì)引物的定量結(jié)果的基本趨勢(shì)也是一致的，就是甲烷囊菌含量在樣本中含量的明顯趨勢(shì)為老窖池＞新窖池。即使在老廠區(qū)的窖泥樣本中也有一些甲烷囊菌含量偏低（如3、5、6號(hào)樣本），其中可能的具體原因有待于確認(rèn)，可能來自樣本取樣的不均勻性。每個(gè)窖池的窖泥雖然都是9點(diǎn)取樣并混合[21]，但是窖泥粘性很大，很難混合均勻；加上本次研究取樣時(shí)每個(gè)混合樣本中只取出200 mg，很可能帶來一定的樣本均勻性問題。

從窖泥宏基因組的高通量測(cè)序結(jié)果來看[17]，甲烷囊菌在樣本中的豐度排名為第7位，屬于高豐度菌屬。但是其他種類的甲烷菌屬豐度排名都在45名以后，比如Methanocorpusculum排第45名，Methanobacterium排第62名，Methanobrevibacter排第86名，Methanofollis排第88名。這個(gè)豐度排名數(shù)據(jù)提示Methanoculleus應(yīng)該是濃香型白酒釀造過程中“種間氫轉(zhuǎn)移”的主要參與菌屬。本研究對(duì)18個(gè)古井窖泥樣本的初步檢測(cè)結(jié)果表明，老窖池窖泥對(duì)應(yīng)的基因組DNA溶液中甲烷囊菌DNA的拷貝數(shù)大概在2000×108個(gè)/L（圖3），最終換算的結(jié)果是每毫克窖泥中甲烷囊菌DNA目標(biāo)片段的個(gè)數(shù)大概為1.5×106個(gè)。這個(gè)含量的準(zhǔn)確度還可以在后續(xù)的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。不過，未來確實(shí)需要檢測(cè)發(fā)酵過程中不同甲烷菌屬的動(dòng)態(tài)變化過程，同時(shí)要逐步研究還需要哪些其他的厭氧菌協(xié)同完成上述“種間氫轉(zhuǎn)移”過程。

圖2 兩對(duì)引物實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)的熔解曲線Fig.2 Melting curves of real-time RT-QPCR of two pairs of primers

圖3 兩對(duì)引物的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果Fig.3 Results of RT-QPCR of two pairs of primers

已知甲烷囊菌的特異性引物非常少[12]。本研究的兩對(duì)引物為研究人員提供了更多選擇。鑒于甲烷菌屬在濃香型白酒發(fā)酵過程中的作用非常獨(dú)特，后續(xù)需要對(duì)不同的甲烷菌屬都要設(shè)計(jì)更多更好的PCR引物。本研究并沒有比較已知甲烷囊菌引物與2對(duì)引物在測(cè)定18個(gè)樣本中的特異性差異和QPCR定量結(jié)果差異。主要原因在于，一是菌群中既有的基因組序列背景信息很有限，這決定了引物的特異性還達(dá)不到100%；另外，不同白酒的不同發(fā)酵樣本中菌群的組成差異非常大，而幾對(duì)引物面向不同菌群基因組背景時(shí)各自表現(xiàn)出來的特異性程度肯定是不同的。所以到底哪一對(duì)引物的特異性最好取決于使用的具體的樣本，研發(fā)人員需要在實(shí)際的測(cè)試過程中找到適合所用樣本的最佳引物。

3 結(jié)論

本研究以古井貢酒窖泥中的甲烷囊菌為研究對(duì)象，通過使用傅里葉轉(zhuǎn)換多序列比對(duì)（MAFFT）工具，分析了甲烷囊菌屬在古井貢酒窖泥中含量前30屬中的SNP情況，選出了3個(gè)效果最好的SNP位點(diǎn)，并據(jù)此設(shè)計(jì)出兩對(duì)甲烷囊菌屬特異性引物。特異性檢測(cè)表明，兩對(duì)引物從窖泥混合宏基因組樣本中擴(kuò)增出來的兩段序列皆屬于甲烷囊菌屬，可以用于RT-QPCR測(cè)定古井貢酒窖泥樣本中該菌屬的含量，發(fā)現(xiàn)老窖池優(yōu)質(zhì)窖泥中的甲烷囊菌含量最多，是新窖池普通窖泥4 000多倍?？紤]到甲烷囊菌在濃香型白酒窖泥中比較廣泛存在，本研究所報(bào)道的兩對(duì)引物應(yīng)該可以在其他不同種類的白酒窖泥中所測(cè)試和應(yīng)用。另外，本研究提供的甲烷囊菌屬的特異性測(cè)定方法與濃香型白酒窖泥質(zhì)量評(píng)價(jià)有直接的相關(guān)性。窖泥質(zhì)量一般從窖泥感官、理化指標(biāo)、微生物組成及基礎(chǔ)酒產(chǎn)質(zhì)量等方面綜合評(píng)判。單獨(dú)任何一種因素往往只能作為輔助評(píng)判的工具。研究組前期多項(xiàng)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)古井貢酒老窖池的優(yōu)質(zhì)窖泥其甲烷囊菌平均含量一直比新窖池的普通窖泥明顯要高很多，所以通過窖泥中甲烷囊菌DNA目標(biāo)片段的定量測(cè)定可以輔助評(píng)估窖泥的質(zhì)量。