王 震，張 豪，鄭穗平*

（華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006）

L-精氨酸是一種重要的半必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于食品、保健和醫(yī)藥工業(yè)。L-精氨酸參與多種生理過程，包括刺激激素的分泌，增強(qiáng)傷口愈合和參與一氧化氮的合成[1]。近20年來，提高微生物如谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-精氨酸的能力的方法被廣泛的研究。如利用代謝工程在分子水平對菌株進(jìn)行通路改造[2]和優(yōu)化菌株生產(chǎn)環(huán)境如培養(yǎng)基、溶氧及pH等[3-4]。

作為菌體生長的介質(zhì)，培養(yǎng)基的組成對于L-精氨酸的積累有著最基本、不可替代的重要作用，CGXII培養(yǎng)基是一種不含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基[5]。有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母膏和黃豆餅中的成分分解可以產(chǎn)生氨基酸等小分子，在谷氨酸棒狀桿菌的生產(chǎn)L-精氨酸的過程中，利用不含有有機(jī)氮源的CGXII培養(yǎng)基可以排除有機(jī)氮源的干擾。在之前的工作中，以谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC14067為出發(fā)菌株，通過改造argB基因（268為組氨酸突變?yōu)楣劝彼幔┖瓦^表達(dá)基因argG和argH得到了一株有L-精氨酸生產(chǎn)潛力的菌株ATCC14067-Peftu-argBH268E-argGH（BGH）[6-7]。然而谷氨酸棒狀桿菌BGH在CGXII培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵72 h之后，L-精氨酸的積累量僅為0.6 g/L。因此需要進(jìn)一步優(yōu)化CGXII培養(yǎng)基的成分配比來提高谷氨酸棒狀桿菌的L-精氨酸積累。

遺傳算法是一種借鑒自然界生物選擇進(jìn)化思想的優(yōu)化算法，其應(yīng)用廣泛，不僅可以求取目標(biāo)函數(shù)的極值[8]，還可以優(yōu)化水中有毒物質(zhì)的生物降解過程[9]。遺傳算法也可以應(yīng)用在培養(yǎng)基優(yōu)化，其相較于常規(guī)培養(yǎng)基優(yōu)化方法如單因素分析[10]、正交試驗[11]、均勻設(shè)計[12]及響應(yīng)面分析[13]，具有優(yōu)化范圍廣、優(yōu)化參數(shù)多和搜索速度快的優(yōu)點[14]，在相同優(yōu)化水平下，遺傳算法所需的試驗次數(shù)可以極大的減少，縮短優(yōu)化時間，提高優(yōu)化效率[15]。本試驗通過遺傳算法不斷優(yōu)化CGXII培養(yǎng)基組分配比，以快速提高谷氨酸棒狀桿菌產(chǎn)L-精氨酸積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

谷氨酸棒狀桿菌ATCC14067-Peftu-argBH268E-argGH（BGH）：本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硫酸銨、尿素、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鈣、七水硫酸鐵、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、無水硫酸銅、六水氯化鎳、原兒茶酸、3-瑪琳丙磺酸（3-morpholinopropanesulfonic acid，MOPs）、碳酸氫鈉、瓊脂糖：廣州普博儀器（紐普諾博生物制品）有限公司；腦心浸液：美國BD公司；2,4-二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene，DNFB）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

CGXII初始培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，硫酸銨20 g/L，尿素5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.25 g/L，氯化鈣10 mg/L，七水硫酸鐵10 mg/L，一水硫酸錳10 mg/L，七水硫酸鋅1 mg/L，無水硫酸銅0.2 mg/L，六水氯化鎳0.02 mg/L，原兒茶酸30 mg/L，MOPs 42 g/L。

腦心浸液瓊脂（brain heart infusion，BHI）固體培養(yǎng)基：腦心浸液37 g/L，瓊脂糖2 g/L。

BHI液體培養(yǎng)基：腦心浸液37 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2350型紫外分光光度儀：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：濟(jì)南柏盛生物科技有限公司；5430R離心機(jī)：德國Eppendorf公司；Waters e2695高效液相色譜（配備有Waters 2489紫外分光光度計）：沃特世科技（上海）有限公司；GeminiNXC18色譜柱（5 μm×250mm）：廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 遺傳算法參數(shù)

CGXII培養(yǎng)基包含15種物質(zhì)成分，其中作為唯一碳源的葡萄糖和作為pH緩沖試劑的MOPs不參與遺傳算法優(yōu)化。考慮到遺傳算法優(yōu)化過程中，培養(yǎng)基成分的不同配比會導(dǎo)致菌體新陳代謝速度的改變，進(jìn)而引起碳源消耗速率的改變，為了避免作為唯一碳源的葡萄糖在發(fā)酵后期被消耗殆盡，干擾遺傳算法優(yōu)化的結(jié)果，因此在遺傳優(yōu)化的整個過程中，把培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度固定為80 g/L。作為pH緩沖試劑的MOPs固定為42g/L，使用之前用4mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8。

遺傳算法優(yōu)化中，染色體代表培養(yǎng)基，位于染色體上的基因代表相對應(yīng)的培養(yǎng)基組分的濃度。遺傳算法優(yōu)化CGXII培養(yǎng)基分為四個步驟，如圖1所示，第一步是確定優(yōu)化的培養(yǎng)基物質(zhì)范圍和優(yōu)化水平，并隨機(jī)創(chuàng)建初始種群，第二步根據(jù)初始種群的的適應(yīng)度函數(shù)（本研究設(shè)定為72 h的L-精氨酸積累量），選擇優(yōu)良個體，第三步根據(jù)交叉規(guī)則，將初始種群所產(chǎn)生的優(yōu)良個體進(jìn)行隨機(jī)交叉，第四步進(jìn)行突變操作，增加基因的多樣性。生成種群重復(fù)選擇、交叉和突變，直到優(yōu)化達(dá)到瓶頸。

圖1 遺傳算法流程圖Fig.1 Flow chart of genetic algorithm

在本實驗利用遺傳算法優(yōu)化培養(yǎng)基的設(shè)置中，種群大小固定為15，每個個體兩次平行來減少誤差。染色體編碼采用二進(jìn)制編碼，每個基因的編碼的長度為6位，即染色體總長度為78位。選擇算法采用輪盤賭算法[16]。交叉方式為4基因的異步獨立交叉，交叉概率0.8。突變方式為單點突變，突變概率0.19。

1.3.2 發(fā)酵方法

將保存的菌體BGH在BHI固體培養(yǎng)基平板上劃線（根據(jù)需要添加25 mg/L的卡那霉素（kanamycin，Kan）抗性），30℃恒溫培養(yǎng)36 h。挑取單菌落，接種至BHI液體培養(yǎng)基，30℃、250r/min培養(yǎng)至OD600nm≈10，轉(zhuǎn)接至裝有50mLCGXII培養(yǎng)基（遺傳算法生成）的250 mL錐形瓶中，初始OD600nm控制在0.2，為避免BHI培養(yǎng)基干擾試驗結(jié)果，轉(zhuǎn)接之前4 000 r/min離心5 min并棄去上清。在30℃、250 r/min的條件下培養(yǎng)72 h，每隔24 h取樣測量細(xì)胞干質(zhì)量和殘?zhí)牵?2 h測量L-精氨酸產(chǎn)量。每種培養(yǎng)基兩次平行，減少試驗的隨機(jī)誤差。

1.3.3 測定方法

細(xì)胞干質(zhì)量測定：取不同時期的發(fā)酵液利用分光光度儀在波長600 nm處檢測吸光度值，同時取10 mL發(fā)酵液14 000 r/min離心5 min，棄上清，用0.5 mol/L（NH4）HCO3溶液重選洗滌3次[17]，在110℃烘干至質(zhì)量恒定并檢測質(zhì)量，回歸擬合得到細(xì)胞干質(zhì)量（cell dry mass，CDM）與發(fā)酵液OD600nm的換算關(guān)系，如公式所示：

CDM=0.306 2×OD600nm

殘留葡萄糖濃度測定：利用SBA-40E生物傳感分析儀進(jìn)行測定殘?zhí)恰?/p>

氨基酸含量測定：氨基酸的測定依據(jù)DNFB衍生法[18]。將菌液離心取上清，樣品稀釋5倍，之后去稀釋后的液體150 μL，加入0.5 mol/L的NaHCO（3pH 9.07）150 μL，再加入DNFB溶液（準(zhǔn)確吸取1 mL 2,4-二硝基氟苯，用乙腈定容至100 mL）150 μL?；靹?，在暗處60 ℃水浴反應(yīng)1 h，反應(yīng)完成后暗處冷卻至室溫，加入1 050 μL的PBS緩沖溶液（pH7.0），暗處靜置10 min，然后14 000 r/min離心10 min以去除雜質(zhì)，最后用有機(jī)濾膜過濾轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液的處理同上。流動相A溶液為0.05 mol/L的乙酸鈉溶液。稱取無水乙酸鈉4.1 g，加入超純水990 mL，調(diào)節(jié)pH至6.8，再加入N,N-二甲基甲酰胺10 mL。有機(jī)濾膜過濾，然后超聲30 min排除氣泡。流動相B溶液是乙腈與水按55∶45（V/V）的體積比配制，流速1 mL/min，檢測溫度30℃，檢測波長360 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳算法的培養(yǎng)基成分優(yōu)化

CGXII培養(yǎng)基中包含有15種成分，除去作為唯一碳源的葡萄糖和作為pH緩沖試劑的MOPs，剩余的13種培養(yǎng)基成分都參與了本次的遺傳算法優(yōu)化。在參與遺傳算法優(yōu)化的13種培養(yǎng)基成分，根據(jù)用量的多少，可以劃分為大量成分和微量成分，其中硫酸銨、尿素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂為大量成分，剩余8種為微量成分。在劃定遺傳算法對于不同的培養(yǎng)基成分的優(yōu)化范圍時，為了提高優(yōu)化效率，減少優(yōu)化步驟，13種培養(yǎng)基成分的優(yōu)化范圍都依據(jù)CGXII初始培養(yǎng)基中各個培養(yǎng)基成分的濃度進(jìn)行劃定，每種培養(yǎng)基成分的具體優(yōu)化范圍見表1。優(yōu)化步長的設(shè)置與遺傳算法中個體染色體上的基因長度相關(guān)，在表1中同時也給出了遺傳算法的優(yōu)化步長。本研究中，代表每種培養(yǎng)基的基因長度為6位二進(jìn)制數(shù)字，即個體的染色體（包含參與優(yōu)化的13種培養(yǎng)基基因）為78位二進(jìn)制數(shù)字。

表1 CGXII培養(yǎng)基成分優(yōu)化范圍與步長Table1 Range and step size of CGXII medium components optimization

種群大小固定為15，初始種群的生成采用隨機(jī)方式，通過1.3方式搖瓶發(fā)酵并檢測72 h的L-精氨酸積累量，根據(jù)每個個體的精氨酸積累量進(jìn)行評價并選擇優(yōu)良個體，常用的選擇算法包括輪盤賭算法，錦標(biāo)賽算法和隨機(jī)遍歷抽樣法，本研究選用了簡潔高效的輪盤賭算法。通過輪盤賭算法得到的優(yōu)良個體，需進(jìn)行交叉操作，來混合組成新的個體。交叉操作涉及到交叉概率和交叉基因個數(shù)[19-20]，因為本次優(yōu)化的培養(yǎng)基成分多達(dá)13種，為保證基因混合充分，交叉基因個數(shù)設(shè)定為4，并且4基因的交叉方式為異步獨立交叉，交叉概率設(shè)定為0.8。通過選擇和交叉操作所得的新個體，其基因都來自于初始種群，因此初始種群即限定了最終的優(yōu)化結(jié)果，為了增加種群基因的多樣性，引入突變操作，突變概率控制基因多樣性的程度，本研究的突變概率為0.19。通過選擇、交叉和突變生成新一代種群，之后不斷的重復(fù)上述過程，直到新生成個體的L-精氨酸產(chǎn)量提升很低或者L-精氨酸積累量減少。

圖2 遺傳算法優(yōu)化谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵過程中L-精氨酸積累情況Fig.2 L-arginine accumulation in the fermentation process byCorynebacterium glutamicumoptimized by genetic algorithm

遺傳算法生成的四代種群搖瓶發(fā)酵72 h的L-精氨酸積累值見圖2。精氨酸生產(chǎn)過程中每代種群L-精氨酸產(chǎn)量的平均值和最優(yōu)值對比見圖3。從圖2可以看出，菌株BGH在CGXII初始培養(yǎng)基（gen_（1～4）-0）發(fā)酵72 h后，精L-精氨酸的積累值僅為0.61g/L。而BGH菌株在初代種群的最優(yōu)個體gen_1-11培養(yǎng)基發(fā)酵72h的L-精氨酸積累值達(dá)到了1.68g/L，第二代、第三代和第四代種群的最優(yōu)個體（gen_2-13、gen_3-14、gen_4-7）在同樣條件下的L-精氨酸積累值分別為1.94g/L、2.37g/L、2.12g/L。經(jīng)過四代遺傳算法優(yōu)化，得到的最優(yōu)個體為gen_3-14，BGH在gen_3-14培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，L-精氨酸積累值達(dá)到2.37 g/L，相較于CGXII初始培養(yǎng)基提高了288.5%。

由圖3可知，雖然在最優(yōu)個體上第四代種群表現(xiàn)不如第三代種群，但從種群整體來考慮，第四代種群L-精氨酸的平均積累值（1.60 g/L）高于第三代種群L-精氨酸的平均積累值（1.46 g/L）。說明遺傳算法仍在繼續(xù)富集優(yōu)良基因并傳遞到下一代種群。

圖3 發(fā)酵過程中每代種群L-精氨酸產(chǎn)量的平均值和最優(yōu)值對比Fig.3 Comparison of the average and optimal L-arginine production of each generation population in the fermentation process

2.2 遺傳算法優(yōu)化過程中的生長與碳源消耗分析

圖4 發(fā)酵過程中每代種群生物量的平均值和L-精氨酸積累最多個體的生物量對比Fig.4 Comparison of average biomass of each generation population and biomass of the individuals with the highest L-arginine accumulation in the fermentation process

由圖4可知，在0～24 h的時間段內(nèi)，隨著優(yōu)化的進(jìn)行，種群的平均細(xì)胞干質(zhì)量整體為一個下降趨勢，而相對應(yīng)的24～48h和48～72h的時間段內(nèi)，種群的平均細(xì)胞干質(zhì)量呈現(xiàn)一種上升趨勢。具體到每代種群的最優(yōu)個體（圖4中的點線圖），也有類似的生長模式的變化趨勢。

由圖5可知，在0～24 h時間段，葡萄糖的消耗量隨著優(yōu)化的進(jìn)行而逐漸降低，24～48 h的時間段內(nèi)則為增加的趨勢。因為相較于積累代謝產(chǎn)物，菌體快速的生長繁殖過程所消耗的能量更大，圖5的變化趨勢進(jìn)一步佐證了圖4所示的生長模式的變化趨勢。

這一現(xiàn)象說明，經(jīng)過遺傳算法優(yōu)化之后，培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵的整個過程中，都更有利于菌體保持正常的生理狀態(tài)，不會因為代謝副產(chǎn)物的積累影響代謝功能的紊亂進(jìn)而產(chǎn)生菌體死亡的現(xiàn)象。

圖5 發(fā)酵過程中每代種群的葡萄糖消耗量平均值和L-精氨酸積累最多個體葡萄糖消耗量的對比Fig.5 Comparison of average glucose consumption of each generation population and the glucose consumption of individuals with the highest L-arginine accumulation in the fermentation process

2.3 遺傳算法優(yōu)化過程中優(yōu)良個體的代謝分析

谷氨酸棒狀桿菌的L-精氨酸代謝簡圖見圖6。代謝圖涉及到了TCA循環(huán)上的α-酮戊二酸和草酰乙酸兩個節(jié)點（即A、B框）以及糖酵解途徑末端的丙酮酸節(jié)點（C框）。谷氨酸棒狀桿菌BGH在遺傳算法所涉及的有代表性4個培養(yǎng)基中分別發(fā)酵72 h后的氨基酸對比結(jié)果見圖7（a、b和c分別對應(yīng)代謝簡圖中的A、B和C框內(nèi)的氨基酸）。

圖6 谷氨酸棒狀桿菌中L-精氨酸的代謝圖Fig.6 Metabolic map of L-arginine inCorynebacterium glutamicum

由圖7a可知，α-酮戊二酸節(jié)點上，相較于CGXII-0培養(yǎng)基，谷氨酸棒狀桿菌BGH在另外3種培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h后的谷氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸和L-精氨酸的積累量都提高了，說明CGXII培養(yǎng)基的改變，增強(qiáng)了α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為L-精氨酸的代謝途徑。另外，培養(yǎng)基優(yōu)化前后的脯氨酸產(chǎn)量都為0，谷氨酸積累速度的提高對于脯氨酸的代謝并未產(chǎn)生任何影響。由圖7b可知，谷氨酸棒狀桿菌BGH在遺傳算法優(yōu)化之后的培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h后，草酸乙酰節(jié)點下的天冬氨酸以及以草酸乙酰為前提的賴氨酸，蛋氨酸和異亮氨酸，相較于優(yōu)化前培養(yǎng)基CGXII-0都有不同程度的提高。然而，在糖酵解途徑末端的丙酮酸節(jié)點下的丙氨酸。纈氨酸和亮氨酸，相較于CGXII優(yōu)化之前，積累量都明顯下降。

圖7 四種培養(yǎng)基的氨基酸代謝對比Fig.7 Comparison of amino acid metabolism in four kinds of media

通過遺傳算法的培養(yǎng)基優(yōu)化，TCA循環(huán)上的α-酮戊二酸和草酰乙酸這兩個節(jié)點下的氨基酸的積累量都有所提高，丙酮酸作為糖酵解末端的生成物質(zhì)，也是TCA循環(huán)上的乙酰輔酶A的前提物質(zhì)，其節(jié)點下的氨基酸的積累量都明顯減少。可見，對于谷氨酸棒狀桿菌BGH，遺傳算法優(yōu)化之后的培養(yǎng)基相較于初始CGXII培養(yǎng)基CGXII-0，可以促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，抑制丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸，增強(qiáng)了TCA循環(huán)及相關(guān)代謝支路。糖酵解的丙酮酸節(jié)點的氨基酸分流減弱和TCA循環(huán)增強(qiáng)的代謝水平改變規(guī)律，或許可以為L-精氨酸以及其他氨基酸的基因工程育種提供一個很有潛力的方向。

3 結(jié)論

通過遺傳算法優(yōu)化CGXII培養(yǎng)基，得到更有利于谷氨酸棒狀桿菌BGH積累精氨酸的新培養(yǎng)基CGXII-gen_3-14，L-精氨酸產(chǎn)量從0.61g/L提升至2.37g/L。遺傳算法優(yōu)化之后的培養(yǎng)基，更有利于谷氨酸棒狀桿菌的生長。通過進(jìn)一步的代謝分析發(fā)現(xiàn)，遺傳算法優(yōu)化的培養(yǎng)基減少丙酮酸支路氨基酸的積累，增強(qiáng)TCA循環(huán)的流量，從而使L-精氨酸的產(chǎn)量提高。