曹 利，車程川，劉金鋒，鞏志金，梁光杰，楊 革*

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

黃曲霉（Aspergillus flavus）屬于腐生真菌，是一種在自然界中普遍存在的霉菌，多寄生于糧食、食品和飼料中并產(chǎn)生黃曲霉毒素。由于黃曲霉污染糧食和飼料所導(dǎo)致的人畜曲霉病病例越來越多[1-3]，1993年，世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）將其認(rèn)定為一種天然致癌物，并且毒性極強(qiáng)。目前，抑制黃曲霉采用的主要方法有物理法、化學(xué)法和生物法。其中生物法具有安全、高效、耗能少，對產(chǎn)品無污染，不影響其營養(yǎng)價值的優(yōu)點，因此，黃曲霉的生物脫毒法具有廣泛的應(yīng)用前景。

放線菌（Actinomycetes）一直以來就是天然抗菌活性物質(zhì)的主要來源，隨著深海探測技術(shù)的提高，人們將探索的范圍延伸到了深海，從海樣沉積物中發(fā)現(xiàn)了大量的海洋放線菌。目前已發(fā)現(xiàn)的1000多種微生物來源的生物活性物質(zhì)中，大約有2/3的活性物質(zhì)來自于放線菌的次生代謝物[4]，如新生霉素、中生菌素、抑霉菌素[5-7]等。目前，已知很多放線菌代謝產(chǎn)物能夠很好地抑制黃曲霉的生長或?qū)S曲霉毒素進(jìn)行降解，SCHUMACHER R W等[8]從鏈霉菌（Streptomycessp.）BD21-2中分離得到一種聚酯醚類化合物Bonactin，該物質(zhì)具有廣譜的抗真菌作用；KLICH M A[9]從低海拔沙漠棉花地分離到多種能抑制黃曲霉的真菌；ONO M等[10]從鏈霉菌中提取到一種稱為aflastatin的物質(zhì)，質(zhì)量濃度為0.5μg/mL時就能完全抑制寄生曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素；劉姝等[11]研究發(fā)現(xiàn)，放線菌GB-2產(chǎn)生的一種廣譜、高活性抗菌物質(zhì)對黃曲霉具有明顯的抑制作用，這對農(nóng)業(yè)的生物防治具有重大的研究價值。但目前為止，國內(nèi)外還未見將拮抗菌應(yīng)用于生物防治黃曲霉的報道。

本研究從黃海海域沉積物中篩選出一株能夠抑制黃曲霉的海洋放線菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，并通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗以及響應(yīng)面試驗對其產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究拓展了糧食生產(chǎn)與加工工業(yè)中黃曲霉污染的防治途徑，為后續(xù)該菌株的生產(chǎn)應(yīng)用開發(fā)提供實驗來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌種

黃曲霉（A.flavus）：由中國普通微生物菌種保藏管理中心（Chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，CGMCC）提供，保藏號為CGMCC3.3950。

1.1.2 培養(yǎng)基

腐植酸固體培養(yǎng)基（humic acid，HA）[12]：腐植酸1 g，CaCO30.02 g，Na2HPO40.5 g，MgSO·47H2O 0.5 g，KCl 1.7 g，F(xiàn)eSO·47H2O0.01g，維生素B（vitaminB，VB）母液（2μL/mL）1 mL，海水1 L，瓊脂20 g，pH 7.4～7.6，115 ℃滅菌30 min，倒板前添加終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的萘啶酮酸抑制細(xì)菌的生長，添加終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的重鉻酸鉀溶液抑制細(xì)菌和真菌的生長[13]。

高氏一號固體培養(yǎng)基[14]：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO·47H2O 0.01 g，MgSO·47H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，海水1 L，瓊脂20 g，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麥芽浸粉10 g，葡萄糖4 g，酵母浸粉4 g，海水1 L，pH 7.4～7.6，115 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH自然，115℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

陽性細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒：美國Sigma公司；酵母浸粉、麥芽浸粉、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HNY-1102型搖床：天津歐諾儀器股份有限公司；DK-8D型水浴鍋、GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；3-18K型臺式高速冷凍離心機(jī)：美國Sigma公司；T100型PCR儀：美國BioRad公司；DYY-6C型核酸電泳儀：北京六一儀器廠；PHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 放線菌菌株的分離篩選

采用分散和差速離心法（dispersion and differential centrifugation，DDC）[15]對樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別取稀釋度為10-2～10-4的稀釋液0.2 mL涂布于腐植酸固體培養(yǎng)基上，30℃條件下靜置培養(yǎng)7～14 d。采用高氏一號固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離、純化。

1.3.2 抑菌活性的測定

種子液的制備：取斜面保藏的菌株B11接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d，用打孔器取兩菌塊接種到高氏一號液體培養(yǎng)基中，200 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)36 h。

發(fā)酵液制備：以2%（V/V）的接種量將種子液接種到裝液量為50 mL/250 mL的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，200 r/min、28℃條件下振蕩培養(yǎng)7d。發(fā)酵液經(jīng)12000r/min離心20min，取上清液備用。

生測平板的制備：待PDA培養(yǎng)基熔化后，溫度降至50～55℃時，加入黃曲霉孢子懸液，使孢子濃度為2×104～4×104CFU/mL，混勻，倒入培養(yǎng)皿。

抑菌活性的測定：在生測平板兩端各置一直徑為8 mm的牛津杯，在牛津杯中各加入200 μL發(fā)酵上清液。28℃條件下培養(yǎng)72 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，并利用十字交叉法測量抑菌圈直徑[16]，當(dāng)抑菌圈直徑＞牛津杯直徑（8 mm）時說明有抑菌活性[17]。

1.3.3 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：取少量菌株B11接種到高氏一號固體培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)7 d，對菌株的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察[18-19]。

生理生化試驗：參照《鏈霉菌鑒定手冊》[20]對篩選菌株進(jìn)行生理生化試驗。

分子生物學(xué)鑒定：采用陽性細(xì)菌基因組試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板對菌株的16SrDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和2（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[21]。PCR擴(kuò)增體系：模板2μL，2×TaqMix25μL，引物12μL，引物22μL，雙蒸水（ddH2O）19 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸75 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切膠回收，送往上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information）上進(jìn)行BLAST比對搜索，選取同源性較高的菌株，采用MEGA 6.0中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件優(yōu)化

Plackett-Burman（PB）試驗：在單因素的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman設(shè)計法從發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、初始pH值（C）、發(fā)酵時間（D）4個影響因素中篩選影響篩選菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的主要影響因素，每個因素分別取2個水平，Plackett-Burman試驗因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table1 Factors and levels of Plackett-Burman tests

最陡爬坡試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上確定初始pH值為7.0。通過最陡爬坡試驗對Plackett-Burman試驗設(shè)計的各因素結(jié)果進(jìn)行分析，使所選的各個因素水平趨近最大抑菌區(qū)域[22]，再根據(jù)各因素效應(yīng)值大小確定變化的步長，找出峰值，使其快速地逼近最佳值。

Box-Behnken試驗：根據(jù)最陡爬坡試驗確定的關(guān)鍵因素與水平，以主要影響因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken法[23-24]設(shè)計響應(yīng)面試驗，擬合得到自變量與響應(yīng)值之間的回歸方程，并繪制因素間相互作用對抑菌圈直徑影響的響應(yīng)面和相應(yīng)的等高線[16]。

回歸模型驗證試驗：為驗證響應(yīng)面優(yōu)化建立模型的準(zhǔn)確性，對預(yù)測的最佳發(fā)酵條件和初始發(fā)酵條件分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，平行試驗3次，結(jié)果取平均值[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗黃曲霉菌株的分離與篩選

通過初篩共篩選到105株海洋放線菌，通過牛津杯法對分離出的海洋放線菌的抑黃曲霉活性進(jìn)行測定，從中分離出4株對黃曲霉具有較強(qiáng)抑制作用的海洋放線菌，編號為B11、C、Y6、M21，各菌株的抑制效果見圖1，抑菌圈直徑見表2。

圖1 各菌株對黃曲霉的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of each strain onAspergillus flavus

表2 各菌株對黃曲霉的抑制作用Table2 Inhibition effect of each strain onAspergillus flavus

由圖1及表1可知，菌株B11、C、Y6、M21對黃曲霉均具有抑制作用，其中，菌株B11的抑菌圈直徑最大，為（1.4±0.15）cm，抑制效果最好。

2.2 菌株B11的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

菌株B11的形態(tài)觀察結(jié)果見圖2。

圖2 菌株B11的菌落形態(tài)（a）、顯微結(jié)構(gòu)（10×100）（b）和掃描電鏡（c）結(jié)果Fig.2 Colonial morphology(a),microscopic structure(b)and scanning electron microscope(C)result of strain B11

由圖2a可知，菌株B11在高氏一號培養(yǎng)基上生長良好，菌落呈橢圓形、淡黃色，表面呈絨狀凸起。由圖2b可知，該菌株氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌絲纖細(xì)，形狀多彎曲；成熟后生成了微曲的孢子絲，并有孢子生成。由圖2c可知，該菌株基內(nèi)菌絲豐富，多分支，中間有橫隔，不斷裂；氣生菌絲灰白色，基絲淡黃色，孢子呈長圓形，表面光滑。

2.2.2 生理生化試驗結(jié)果

菌株B11的生理生化試驗結(jié)果見表3。由表3可知，菌株B11可利用D-葡萄糖、乳糖、麥芽糖和D-甘露醇作為碳源，不能利用蔗糖、D-核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和肌醇，能液化明膠、利用纖維素、還原硝酸鹽、不水解淀粉、不產(chǎn)生類黑色素、酪氨酸酶和H2S、也不能使牛奶凝固或胨化。結(jié)合菌株B11的形態(tài)觀察結(jié)果，初步判定其為鏈霉菌屬（Streptomycessp.）。

表3 菌株B11的生理生化試驗結(jié)果Table3 Results of physiological and biochemical tests of strain B11

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株B11的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，菌株B11與銹赤蠟黃鏈霉菌（Streptomycesrubiginosohelvolus）YJ-RT10聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)特征及生理生化試驗結(jié)果，鑒定菌株B11為銹赤蠟黃鏈霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）。

圖3 基于16S rDNA序列分析菌株B11的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain B11 based 16S rDNA sequences analysis

2.3 菌株B11產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果

Plackett-Burman試驗結(jié)果與分析見表4，各因素效應(yīng)分析結(jié)果見表5。

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果與分析Table4 Results and analysis of Plackett-Burman tests

表5 Plackett-Burman試驗各因素效應(yīng)分析Table5 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman tests

由表5可知，該模型結(jié)果顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度（A）對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），接種量（B）和發(fā)酵時間（D）對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而初始pH值（C）對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05），因此，可以確定發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間為其主要影響因子。

通過Plackett-Burman試驗獲得回歸方程：抑菌圈直徑=1.745 3-0.254 7A-0.204 7B-0.095 3C-0.178 1D。由回歸方程可知，發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（D）的系數(shù)均為負(fù)數(shù)，說明對抑菌圈直徑的影響呈負(fù)效應(yīng)。

2.3.2 最陡爬坡試驗結(jié)果

在PB試驗的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵溫度、接種量和發(fā)酵時間的步長分別定為5℃、1%、2 d，然后以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）及發(fā)酵時間（D）為主要影響因素進(jìn)行最陡爬坡試驗，結(jié)果見表6。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table6 Design and results of the steepest ascent tests

由表6可知，各因素在第4組試驗附近取值時，發(fā)酵液的抑菌活性最高，為（2.8±0.09）cm，可知最優(yōu)發(fā)酵條件在第4組附近。因此，選擇第4組試驗的各因素為Box-Behnken試驗的中心點，即發(fā)酵溫度30℃、接種量5%、發(fā)酵時間11d。

2.3.3 Box-Behnken試驗結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗結(jié)果以發(fā)酵溫度（X1）、發(fā)酵時間（X2）、接種量（X3）為自變量，抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。試驗因素與水平見表7，試驗結(jié)果與分析見表8，方差分析結(jié)果見表9。

表7 Box-Behnken試驗的因素與水平Table7 Factors and levels of Box-Behnken tests

運用Desigin-Expertversion8.0.6設(shè)計軟件對表8試驗結(jié)果擬合后得到二次響應(yīng)面回歸方程：Y=2.88-0.12X1-0.10X2+。

由表9可知，模型的P值＜0.01，極顯著，失擬項的P值為0.728 4，影響不顯著（P＞0.05），表明該模型可靠，能較好地分析和預(yù)測響應(yīng)值。其中回歸方程系數(shù)R2=0.981 8，說明該方程與實際情況擬合較好，可信度高，因此，可選用該模型進(jìn)行放線菌B11產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的預(yù)測和分析。其中一次項X1、X3和交互項X2X3對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X2、二次項對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表8 Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table8 Results and analysis of Box-Behnkentests

表9 回歸模型方差分析Table9 Variance analysis of regression model

2.3.4 響應(yīng)面分析

交互作用對放線菌B11產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及接種量間交互作用對放線菌B11產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of the effects of interaction between fermentation temperature,time and inoculum on the inhibiting activity substance production byActinomycetesB11

由圖4可知，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間、發(fā)酵時間和接種量之間的等高線圖形為橢圓形，響應(yīng)面開口向下呈凸型曲面，表明兩因素之間交互作用是顯著的。而發(fā)酵溫度和接種量之間的等高線圖形為近圓形，響應(yīng)面開口向下呈凸型曲面，表明兩因素之間交互作用是不顯著的，且其存在最大值。根據(jù)試驗結(jié)果分析得出，放線菌B11產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時間11 d、接種量5%。

2.3.5 回歸模型的驗證

為驗證模型的真實性與可靠性，對優(yōu)化后的發(fā)酵條件和初始發(fā)酵條件分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗，3次重復(fù)試驗，取平均值。經(jīng)優(yōu)化后，菌株B11的抑菌圈直徑為（2.9±0.15）cm，與預(yù)測值2.91cm接近，抑菌圈直徑比優(yōu)化前（1.4±0.15）cm增大51.72%。說明其優(yōu)化后的條件能明顯提高菌株抑菌活性。

3 結(jié)論

本研究從海洋沉積物中篩選出一株能夠抑制黃曲霉生長的海洋放線菌B11，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)鑒定為銹赤蠟黃鏈霉菌（Streptomyces rubiginosohelvolus）；通過PB試驗得出影響放線菌B11產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的主要因素為發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及接種量，通過最陡爬坡試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化得出其產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件：溫度29℃、培養(yǎng)時間11 d、接種量5%，在此最優(yōu)條件下，抑菌圈直徑達(dá)到（2.9±0.15）cm，較優(yōu)化前增大51.72%。本研究為生物防治糧食種植與貯藏過程中受到黃曲霉侵染提供了廣闊的應(yīng)用前景。