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        利用氧化還原電位優(yōu)化玉米酒精濃醪發(fā)酵過程研究

        2019-04-09 05:10:16李華志熊粟栗袁文娟
        中國釀造 2019年3期
        關(guān)鍵詞:糖醇甘油存活率

        方 帷,李 曉,李華志,熊粟栗,袁文娟,張 杰*

        (1.四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,四川成都 610064;2.資中縣銀山鴻展工業(yè)有限責(zé)任公司,四川內(nèi)江 641200)

        發(fā)酵酒精生產(chǎn)工業(yè)主要是以糧谷為主要原料(如玉米、高粱、薯類和糖蜜等[1])。相比于其他糧食作物,利用玉米生產(chǎn)酒精有許多優(yōu)點[2]:(1)玉米產(chǎn)量大,價格低廉;(2)玉米生產(chǎn)出的酒精品質(zhì)高于其他糧食作物,對人體有害的副產(chǎn)物(如甲醇、異丁醇含量)較少;(3)玉米酒糟污染易于解決:玉米酒糟干燥后直接作為動物干飼料,蛋白含量豐富[3]。在中國,玉米酒精是優(yōu)質(zhì)食用酒精的重要來源。

        氧化還原電位(oxidation-reduction potential,ORP)用來反映水溶液中所有物質(zhì)表現(xiàn)出來的宏觀氧化-還原性。氧化還原電位越高,氧化性越強;電位越低,氧化性越弱。電位為正表示溶液顯示出一定的氧化性,為負則說明溶液顯示出還原性[4-5]。

        微生物的大多代謝由多種多樣的氧化還原反應(yīng)組成,氧化還原電位對微生物的生長繁殖及存活有很大影響,不同的微生物對生長環(huán)境的氧化還原電位有不同的要求[6]。近十年來,氧化還原電位控制發(fā)酵條件,增加目標(biāo)產(chǎn)物的生成,減少副產(chǎn)物積累逐漸引起關(guān)注,已被應(yīng)用于乙醇、丁二酸、琥珀酸、乳酸等發(fā)酵過程優(yōu)化中[7-11]。但將ORP應(yīng)用于乙醇發(fā)酵優(yōu)化研究中,局限于酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基[7-8];利用玉米酒精濃醪發(fā)酵的優(yōu)化研究還鮮有報道。本試驗利用玉米酒精濃醪作為培養(yǎng)基,進行乙醇發(fā)酵研究,探尋最優(yōu)氧化還原電位條件,更接近酒精實際生產(chǎn),為發(fā)酵酒精工業(yè)的過程控制提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1菌種

        安琪超級釀酒高活性干酵母:安琪酵母股份有限公司。

        1.1.2 試劑

        玉米醪:[干玉米粉(淀粉含量60%~62%,水分含量12%),料液比1∶2(g∶mL),經(jīng)糖化處理,總糖含量23 °Bx,初始pH=4.1]:資中縣銀山鴻展工業(yè)有限責(zé)任公司。

        1.1.3 化學(xué)試劑

        3,5-二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS):廈門海標(biāo)科技有限公司;甘油三酯試劑盒:南京建成生物工程研究所;0.1%次甲基藍指示劑:上海展云化工有限公司;葡萄糖(生化試劑):成都科隆化學(xué)品有限公司。試驗所用其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        BIOTECH-5BG離位滅菌玻璃發(fā)酵罐:上海保興生物設(shè)備有限公司;SIN-PH160P ORP控制器:深圳聯(lián)測儀表有限公司;T4805-60-P-PAORP電極:瑞士MettlerToledo公司;DH-30空氣壓縮機:惠州市德鴻空氣壓縮機有限公司;GSCC9SA-BB26流量控制器:瑞士V?gtlin設(shè)備公司;17805E Midisart 2000過濾器:德國Sartorius公司;QT08-LM79-J3酒精計:北京北信未來電子儀器有限公司;EX-ZNHW數(shù)顯恒溫型電熱套:上海力辰邦西儀器科技有限公司;UV-2450紫外可見分光光度計:日本島津公司;DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市醫(yī)療儀器廠;JA1003分析天平:上海天平儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 ORP控制策略

        發(fā)酵罐裝配溫度電極、pH電極、ORP實時監(jiān)測系統(tǒng)(包括ORP控制器和ORP電極)、循環(huán)冷卻水系統(tǒng)、無菌空氣進出系統(tǒng)和玻璃轉(zhuǎn)子流量控制儀。通過發(fā)酵罐控制器將氣體流量計和ORP實時監(jiān)測系統(tǒng)相關(guān)聯(lián),控制通氣量將ORP值控制在預(yù)設(shè)水平。在不控制的乙醇發(fā)酵過程中,ORP值最低能夠降至-150 mV以下,因此將氧化還原電位值控制3個水平:-50 mV、-100 mV、-150 mV,以不控制氧化還原電位的發(fā)酵作為對照組。發(fā)酵初始階段停止通氣,當(dāng)ORP值降到設(shè)定值以下時,控制器開啟氣泵以0.8 L/min的速度泵入空氣,提升ORP直至設(shè)定值。

        1.3.2 發(fā)酵方法

        取4 g干酵母粉,置于40 mL的2%葡萄糖溶液中活化2 h,溫度32℃。將活化液接種于裝有4 L玉米醪的5 L發(fā)酵罐中,溫度28℃,發(fā)酵時間為48 h。

        1.3.3 分析方法

        菌體數(shù)量:血球計數(shù)板法[12]。

        細胞存活率:使用0.1%亞甲基藍染色細胞,染色5 min,在顯微鏡下觀測細胞,存活率為未被染色的細胞數(shù)目與總細胞數(shù)目的比值。

        乙醇測定:取發(fā)酵醪液100 mL于500 mL蒸餾瓶中加入150 mL蒸餾水,采用常壓蒸餾,餾出液用100 mL量筒收集,置數(shù)分鐘,待酒中氣泡消失后,放入酒精計,同時插入溫度計,平衡約5 min,水平觀測,讀取與彎月面相切處的刻度值,同時記錄溫度[13]。

        葡萄糖質(zhì)量濃度測定:DNS法[14];甘油含量測定:甘油三酯試劑盒。

        1.3.4 計算公式

        糖醇轉(zhuǎn)化率是生成乙醇的量與消耗葡萄糖的量的比值,其計算公式如下:

        式中:Yp/s為糖-醇轉(zhuǎn)化率,%;ΔP為生成乙醇的量,g/L;ΔS為消耗葡萄糖的量,g/L。

        發(fā)酵效率為糖醇轉(zhuǎn)化率與理論糖醇轉(zhuǎn)化率的比值,其計算公式如下:

        式中:η為發(fā)酵效率,%;Yp/s為糖醇轉(zhuǎn)化率,%;0.511為理論糖醇轉(zhuǎn)化率,%。

        乙醇生成速率為單位時間內(nèi)乙醇的增量,反映乙醇生成的快慢,其計算公式如下:

        式中:Pro為乙醇生成速率,g/(L·h);ΔP為生成乙醇的量,g/L。Δt為時間的變化量,h。

        1.3.5 數(shù)據(jù)處理

        每個ORP水平(-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照)均重復(fù)試驗6次進行分析,得到的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS Duncun運算分析后,繪制圖表。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 氧化還原電位曲線變化特點

        在裝有4 L玉米醪的5 L發(fā)酵罐中,用ORP電極對發(fā)酵過程中的氧化還原電位變化進行實時監(jiān)控,每隔1 h采集一次ORP值;每個ORP水平(-50mV、-100mV、-150mV、對照)均重復(fù)試驗6次,取平均值,結(jié)果見圖1。

        圖1 發(fā)酵過程中氧化還原電位變化曲線Fig.1 Variation curve of oxidation-reduction potential during fermentation process

        由圖1可知,根據(jù)氧化還原電位變化的趨勢,將乙醇發(fā)酵過程分為ORP下降期、ORP穩(wěn)定期、ORP上升期。在ORP下降期,由于酵母細胞處于遲緩期和對數(shù)期,細胞的快速生長消耗發(fā)酵液中的溶氧和發(fā)酵液上方的空氣,同時產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH),造成了ORP值的迅速下降;當(dāng)ORP值下降至設(shè)定值時,進入ORP穩(wěn)定期,此時控制系統(tǒng)開啟,通過向發(fā)酵罐通入適量的空氣,將ORP值維持在設(shè)定值附近。酵母細胞處于對數(shù)增長的后期和穩(wěn)定期;在ORP上升期,因為發(fā)酵后期乙醇的積累和葡萄糖的消耗殆盡,酵母細胞進入衰亡期,NADH積累減少,ORP值逐步上升,ORP調(diào)控結(jié)束。利用傳統(tǒng)的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基進行乙醇發(fā)酵時,氧化還原電位可下降至-200 mV以下[7-8]。由于玉米醪成分的復(fù)雜性,發(fā)酵時氧化還原電位僅最低降至-176 mV。這可能是因為玉米中含有大量的亞油酸,具有酸性基團-COOH,容易被氧化,使玉米醪的氧化還原電位升高。

        2.2 糖醇轉(zhuǎn)化率和不同氧化還原電位調(diào)控的關(guān)系

        每個ORP水平(-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照)均重復(fù)試驗6次,記錄發(fā)酵起始的葡萄糖和乙醇含量的變化,取平均值進行分析,結(jié)果見表1。每隔8 h或者10 h取發(fā)酵液5 mL,離心5 min后,上清液用于測量葡萄糖含量變化;并用蒸餾法測量發(fā)酵完成乙醇生成量,結(jié)果見圖2和圖3。

        表1 不同氧化還原電位下的糖醇轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵效率和乙醇生成速率Table1 Conversion rate from sugar to ethanol,fermentation efficiency and the production rate of ethanol under different oxidation-reduction potential levels

        圖2 發(fā)酵過程中不同氧化還原電位下葡萄糖的變化曲線Fig.2 Variation curve of glucose under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

        圖3 發(fā)酵過程中不同氧化還原電位下的乙醇生成量Fig.3 Ethanol production under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

        為了比較糖醇轉(zhuǎn)化率,將葡萄糖最初消耗為0時設(shè)置為時間終點。由圖2可知,在4種不同的ORP條件下,將葡萄糖耗盡的時間不同。由表1可知,當(dāng)ORP控制值為-150 mV時,乙醇產(chǎn)量最高為103.36 g/L,分別為ORP值為-50 mV、-100 mV及對照的1.72倍、1.26倍、1.04倍。

        由圖3可知,4種不同的ORP條件下的乙醇產(chǎn)量均具有顯著性差異(P<0.05)。且ORP值為-150 mV時,糖醇轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵效率高于其他三組,為45.52%和88.06%。ORP控制值為-50 mV時,乙醇產(chǎn)量、糖醇轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵效率均最低,說明高溶氧水平導(dǎo)致糖酵解途徑被抑制,乙醇產(chǎn)量降低。當(dāng)ORP控制值為-100 mV時,乙醇生成速率最高,為2.16 g/(L·h),與ORP控制值為-150 mV的乙醇生成速率[2.15 g/(L·h)]相差較?。≒>0.05)。因此,將ORP值控制在-150mV時,糖醇轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵效率及乙醇生產(chǎn)速率均為最佳,分別為45.52%、88.06%、2.15 g/(L·h),對玉米發(fā)酵熟醪利用最好。糖醇轉(zhuǎn)化率是衡量淀粉質(zhì)原料酒精發(fā)酵成績好壞的指標(biāo)之一,其高低與原料消耗有直接關(guān)系。對于發(fā)酵酒精生產(chǎn)行業(yè)而言,利用ORP控制,可以提高酒精產(chǎn)率,減少原料損失。

        2.3 甘油產(chǎn)量和不同氧化還原電位調(diào)控的關(guān)系

        甘油是乙醇發(fā)酵的主要副產(chǎn)物。甘油作為細胞保護劑,可以調(diào)節(jié)滲透壓,在缺氧、低溫、高滲透壓等逆境下,被細胞大量合成;同時甘油也被用于維持細胞內(nèi)的氧化還原電位。細胞內(nèi)過量的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[15-16]通過甘油合成消耗。甘油合成會消耗掉一部分糖分,影響糖醇轉(zhuǎn)化率[17]。每個ORP水平(-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照)均重復(fù)試驗6次,每隔8 h或者10 h取發(fā)酵液5 mL,離心5 min后,上清液用于測量甘油含量變化,結(jié)果見圖4。

        圖4 發(fā)酵過程中不同氧化還原電位下甘油產(chǎn)量變化曲線Fig.4 Variation curve of glycerol production under different oxidationreduction potentials during fermentation process

        由圖4可知,在不同的氧化還原電位控制條件下,甘油產(chǎn)量不同。當(dāng)ORP控制值為-50 mV時,甘油產(chǎn)量最高,為23.13 g/L,分別為ORP值為-100 mV、-150 mV及對照的1.07倍、1.17倍、1.31倍。因此設(shè)定的ORP控制值越高,甘油的產(chǎn)量越高,且甘油在酒精發(fā)酵初期大量產(chǎn)生。原因可能如下兩點:其一,在發(fā)酵初期酵母進行有氧呼吸,細胞內(nèi)累積了大量的NADH,糖酵解途徑的正常進行需要NAD+的再生。第一個是通過乙醇途徑,第二個是通過甘油磷酸途徑[18]。由于發(fā)酵初期缺少醇脫氫酶,NAD+的再生只能通過甘油磷酸途徑;其二,發(fā)酵初期發(fā)酵液中糖質(zhì)量濃度較高(約為230 g/L),產(chǎn)生高滲透壓,磷酸甘油脫氫酶(glycerophosphate dehydrogenase,GPDH)響應(yīng)高滲條件表達,以保護細胞免于脫水。而高ORP值意味著細胞有氧呼吸較為旺盛。

        每個ORP水平(-50 mV、-100 mV、-150 mV、對照)均重復(fù)試驗6次,每隔8 h或者10 h取發(fā)酵液5 mL,離心5 min后,上清液用于測量酵母數(shù)量變化,并結(jié)合甘油生成量進行對比,結(jié)果見圖5。由圖5可知,隨著酵母細胞數(shù)量增加,甘油的產(chǎn)量也隨之升高。在不同氧化還原電位條件下,甘油的產(chǎn)量從發(fā)酵起始點的5.8 g/L分別增至23.13 g/L(-50 mV)、21.65g/L(-100mV)、21.00g/L(-150mV)、19.56g/L(對照);在發(fā)酵8~18 h內(nèi),酵母菌細胞的數(shù)量變化曲線急劇上升,而甘油的產(chǎn)量分別從8.46g/L(-50mV)、8.24g/L(-100mV)、8.32g/L(-150mV)、7.12g/L(對照)增至18.84 g/L(-50 mV)、17.52g/L(-100mV)、15.92g/L(-150mV)、14.29g/L(對照),因此對數(shù)期細胞甘油生成率最大。這可能是因為在對數(shù)期細胞生長旺盛,需要蛋白質(zhì)、脂質(zhì)大量合成,用于生長繁殖。

        圖5 發(fā)酵過程中不同氧化還原電位下酵母菌體數(shù)量與甘油產(chǎn)量的關(guān)系Fig.5 Relationship between yeast number and glycerol production under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

        盡管甘油對細胞有保護作用,但是對于發(fā)酵酒精生產(chǎn)行業(yè)而言,甘油的產(chǎn)生降低了酒精產(chǎn)率,造成碳源浪費。因此,利用氧化還原電極監(jiān)控發(fā)酵液中ORP,可以探尋一個最佳ORP位點,達到酒精產(chǎn)率的最合理化。

        2.4 酵母細胞生長和不同氧化還原電位調(diào)控的關(guān)系

        酵母細胞的數(shù)量對乙醇發(fā)酵至關(guān)重要。每個ORP水平(-50mV、-100 mV、-150 mV、對照)均重復(fù)試驗6次,每隔8 h或者10 h取發(fā)酵液5 mL,離心5 min后,上清液用于測量酵母菌體數(shù)量變化,并計算存活率,結(jié)果見圖6。

        圖6 發(fā)酵過程中不同氧化還原電位下酵母菌的菌體數(shù)量變化曲線Fig.6 Variation curve of yeast number under different oxidationreduction potentials during fermentation process

        由圖6可知,在不同的氧化還原電位控制條件下,酵母細胞的數(shù)量不同??刂芆RP的乙醇發(fā)酵,菌體數(shù)量均大于對照。設(shè)定的ORP值越高,控制系統(tǒng)通入更多的空氣,這對發(fā)酵初期菌體生長有利,因此,酵母細胞數(shù)量越高。在不進行ORP控制的自然情況下,酵母的最高菌體數(shù)量最低,為4.50×109CFU/mL。當(dāng)ORP控制值為-50 mV時,最高菌體數(shù)量達到了5.36×109CFU/mL,分別為ORP值為-100 mV、-150 mV、對照的1.15倍、1.18倍和1.19倍。

        細胞存活率也是發(fā)酵的重要指標(biāo)之一。對比不同氧化還原電位下的酵母存活率,結(jié)果見圖7。

        圖7 發(fā)酵過程中不同氧化還原電位下的酵母存活率Fig.7 Yeast viability under different oxidation-reduction potentials during fermentation process

        由圖7可知,當(dāng)ORP控制值為-150 mV時,發(fā)酵終點的酵母細胞存活率最高,為0.87,分別為ORP值為-50 mV、-100 mV、對照的1.12倍、1.02倍、1.07倍。當(dāng)ORP控制值為-50mV時,雖然其菌體數(shù)量最高,但存活率遠低于其他三組。而ORP控制值為-100mV,其最高菌體數(shù)量雖然與ORP值為-150mV相近,其存活率卻低于后者,說明過多的溶氧對于細胞存活有不利的影響。雖然發(fā)酵液中微量的溶氧可以提高酵母生物合成能力,保持細胞活性[19]。但同時,溶氧水平過高一方面會導(dǎo)致細胞在有氧生長過程中產(chǎn)生活性氧,如過氧化氫、超氧化物等,這些物質(zhì)對細胞造成損傷、死亡和老化[20-21],一方面抑制糖酵解途徑的活性,乙醇合成量減少[22]。所有試驗組在發(fā)酵28 h后,菌體存活率下降,這可能是因為乙醇的累積,對細胞產(chǎn)生毒性。而ORP控制值為-50 mV時,存活率下降趨勢最為劇烈。雖然在此條件下甘油產(chǎn)量最高,可以幫助酵母抵御逆境,但是可能因為葡萄糖的耗盡,使細胞缺少碳源,加上乙醇積累雙重影響,造成細胞死亡。與傳統(tǒng)的YPD培養(yǎng)基相比[7],利用玉米醪進行乙醇發(fā)酵,在相同時間點酵母細胞存活率更高,這可能意味著玉米醪更適合酵母細胞生長。

        因此,對于發(fā)酵酒精生產(chǎn)行業(yè)而言,利用氧化還原電極可以精確檢測發(fā)酵液中溶氧情況,同時適當(dāng)控制ORP值,可以避免酵母細胞的過量生長,維持在高存活率狀態(tài)。

        3 結(jié)論

        本試驗首次將ORP控制運用于工廠玉米醪,監(jiān)控乙醇發(fā)酵過程的酵母的菌體數(shù)量、存活率、糖醇轉(zhuǎn)化率和甘油生成量變化。結(jié)果表明,ORP控制值越高,酵母菌體數(shù)量和甘油生成量越高,恰當(dāng)?shù)腛RP值利于細胞存活率提升。在一定范圍內(nèi),ORP控制值越低,糖醇轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢,而控制值為-150 mV時,糖醇轉(zhuǎn)化率最高。本試驗的最佳ORP控制值為-150 mV。控制氧化還原電位,增加乙醇的生成,減少副產(chǎn)物積累,為發(fā)酵酒精工業(yè)提供思路。

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