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        花生青枯病生防細(xì)菌的篩選與鑒定

        2019-04-09 08:32:58游春平董章勇
        廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年2期

        陸 濟(jì),游春平,董章勇

        (仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,廣東 廣州 510225)

        【研究意義】花生是世界上最主要的油料經(jīng)濟(jì)作物之一,是大部分非發(fā)達(dá)國家和地區(qū)人們的植物油和蛋白質(zhì)的主要來源,其營養(yǎng)價值極高。我國花生種植面積占所有油料作物種植總面積的1/4,總產(chǎn)量卻占全國油料作物總產(chǎn)量的50%以上,為我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展及貿(mào)易出口等作出了極其重要的貢獻(xiàn)[1]。細(xì)菌性青枯病是一種具有極大毀滅性的土傳病害,其病原為茄青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)[3-4]。青枯病是當(dāng)前世界發(fā)生范圍最廣、危害最大、引起損失最重的一種病害。由此造成的花生減產(chǎn)一般為10%~20%,嚴(yán)重時可高達(dá)70%,甚至絕收。在很多作物中尚未有有效的防治措施,因此該病害也被稱為植物的“癌癥”[4]。由于青枯菌在寄生范圍、致病能力、生化型等特性上存在很大差異,增加了這種病害的防治難度[3]。數(shù)十年來大量的研究者以不同的切入點(diǎn)對青枯菌進(jìn)行全面的研究探索,雖然取得了一定的進(jìn)展,但是未能解決生產(chǎn)上的問題。篩選花生青枯病的生物防治菌株對于該病原菌的防控有重要意義,尤其目前我國大力提倡農(nóng)藥減量的防控。【前人研究進(jìn)展】近些年來,青枯雷爾氏菌的生物防治越來越多地引起了國內(nèi)外專家學(xué)者的重視。目前已經(jīng)分離不同的潛在生防菌株,如青枯假單孢桿菌(Pseudomonas solanacarum Smith)[5]、鏈霉菌(Streptomycesspp.)[6]、假單胞桿菌(Pseudomonadaceae)[7]、芽孢桿菌(Bacillus)[8]和閘坡鏈霉菌(Streptomyces zhapoensis)[9]等。篩選到的生物防治菌株包括真菌、細(xì)菌和放線菌等?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然前期開發(fā)了一些生防制劑,但普遍存在防效不穩(wěn)定的現(xiàn)象,因此希望開發(fā)出更多的生防制劑進(jìn)行替代和補(bǔ)充[10]?!緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選到對花生青枯病有較好拮抗作用的生物防治細(xì)菌菌株,并進(jìn)行鑒定,為該病的生物防治打下基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試花生青枯病致病菌株由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。供試培養(yǎng)基為改良的PDA培養(yǎng)基、TTC平板等培養(yǎng)基,其配置參照植物病原細(xì)胞研究技術(shù)[11]。盆栽試驗(yàn)花生品種為航花3號,由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鄭奕雄教授提供。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 花生青枯菌拮抗菌株的分離和純化 將采集自廣州市內(nèi)公園及仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院校園的土樣進(jìn)行風(fēng)干處理,將風(fēng)干的10 g植株根部土壤放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中, 放入搖床以170 r/min振蕩30 min, 制成土壤懸浮液。經(jīng)過稀釋后涂NA平板,再放入28 ℃黑暗的恒溫箱中培養(yǎng),48 h后挑選出其中典型的單菌落, 經(jīng)平板劃線進(jìn)行純化, 并放入4°C冰箱保存待用。

        1.2.2 花生青枯病拮抗菌的篩選 經(jīng)純化的菌株用點(diǎn)接法進(jìn)行初篩,操作過程如下: 將培養(yǎng)的青枯病菌懸液濃度稀釋為1×108CFU/mL, 從中取0.1 mL均勻地涂抹于NA平板上, 將滅菌后小圓片浸入土壤分離菌中,再放入涂有青枯病菌的平板中央。每個分離物重復(fù)3次。于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后觀察拮抗效果。

        1.2.3 拮抗菌發(fā)酵液對花生青枯病菌的抑制作用 將抑制效果較好的拮抗菌株接種到NB液體培養(yǎng)基中,在30 ℃下于170 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d,將發(fā)酵液在12 000 r/min下離心20 min, 取上清液,經(jīng)過濾滅菌,獲得無菌發(fā)酵液。將浸過無菌發(fā)酵液的圓片放入涂有青枯病菌的平板中央。每個拮抗菌株重復(fù)3次。于28℃下恒溫箱中培養(yǎng)48 h后觀察拮抗效果,計(jì)算抑制率。

        1.2.4 拮抗菌的盆栽防治試驗(yàn) 盆栽防治試驗(yàn)使用4~5片葉子的苗期進(jìn)行試驗(yàn)。先用灌根法接種生防菌,48 h后再接青枯雷爾氏菌液,每種生防菌發(fā)酵液澆灌60株植株。以60株直接接種青枯雷爾氏菌液(1.0×108CFU/mL)20 mL作為對照,每個處理3次重復(fù)。接種青枯雷爾氏菌液3 d后開始記錄花生植株的生長和發(fā)病情況,持續(xù)觀察30 d。計(jì)算病株率和防治效果。

        1.2.5 拮抗菌A38的鑒定 菌株總DNA提取利用東盛生物的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒進(jìn)行。PCR擴(kuò)增引物使用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F/1492R(White等, 1990)。將擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序,測序得到的結(jié)果在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行比對分析。使用軟件MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis,Version6.0)進(jìn)行序列比較,采用Kimura 2-parameter(Kimura-2參數(shù))模型,采用neighbor joining 程序,boot strap 為1 000次。菌株的生理生化性狀參照《伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊》(第2版)和《常見細(xì)菌鑒定手冊》。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 花生青枯菌拮抗菌發(fā)酵液對花生青枯病菌的抑制作用

        采用平板稀釋法從植物根際土壤中分離出300余株形態(tài)和顏色不同的細(xì)菌菌株,對這些菌株進(jìn)行花生青枯菌拮抗試驗(yàn)。結(jié)果表明,對青枯雷爾氏菌有拮抗作用的菌株有7株,約占總菌株數(shù)的1.8%左右,抑菌圈直徑范圍為5.0~16.0 mm,菌株為Aa、Ab、Af、Ai、A9、A27 和A38,其中A38菌株對花生青枯菌的抑菌效果最好,抑菌圈直徑為16.0 mm,其次為Ab和A27菌株,抑菌圈直徑分別為11.5 mm和13.5 mm(表1)。

        表1 拮抗菌株對青枯雷爾氏菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of antagonistic bacterial strains on R. solanacearum

        2.2 拮抗菌株無菌濾液對青枯雷爾氏菌的抑制作用

        選擇抑菌圈直徑大于10.0 mm的3個菌株Ab、A27和A38的無細(xì)胞發(fā)酵液進(jìn)行抑菌測定,結(jié)果顯示,3個菌株Ab、A27和A38的無細(xì)胞發(fā)酵液對青枯病菌都有明顯的抑制作用,抑制圈直徑分別為9.5、10.5、15.0 mm,差異極顯著,表明3株細(xì)菌的胞外分泌物對青枯雷爾氏菌起拮抗作用。

        2.3 生防菌盆栽防治效果

        利用前期在平板拮抗試驗(yàn)中對花生青枯菌有較好拮抗作用的3個菌株進(jìn)行盆栽防治試驗(yàn),結(jié)果(表2)表明,拮抗菌Ab、A27和A38對花生青枯病均具有一定的防治效果,防治效果分別為12.16%、25.66%和52.71%,以A38菌株的防治效果較好,此防效有一定的研究價值,可進(jìn)一步進(jìn)行大田試驗(yàn)。

        表2 拮抗細(xì)菌對花生青枯菌的溫室盆栽防治效果Table 2 Control effects of antagonistic bacteria on bacterial wilt of peanuts in greenhouse

        2.4 A38菌株的鑒定

        利用通用引物 27F/1492R 對生防菌A38的16S rRNA 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,獲得大小為1 435 bp 產(chǎn)物,并與 GenBank 上序列進(jìn)行比對,結(jié)果顯示,與菌株A38 16S rDN A序列相似性99%的細(xì)菌只有Pseudomonas aeruginosa。

        菌株A38在NA培養(yǎng)基上的菌落為圓形,其顏色乳白不透明,表面有光澤、粘稠狀、微隆起、邊緣光滑、整齊、波狀,在革蘭氏染色中為陰性。

        根據(jù)上述基因序列分析結(jié)果,參照《伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊》(第2版)選擇19項(xiàng)生理生化性狀進(jìn)行測定,結(jié)果(表3)顯示,菌株A38不僅能對部分糖或醇如木糖、核糖、半乳糖和葡萄糖等都能進(jìn)行有效的利用,并且菌株A38能使明膠液化,但不能進(jìn)行反硝化作用,能在42℃下生長,但卻不能在8.5%NaCl下生長。生理生化特征測定結(jié)果也表明A38菌株的特性與綠膿假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的特性相似,相似性達(dá)78.95%。

        表3 生防菌A38的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of biocontrol bacterium A38

        3 討論

        國內(nèi)外篩選出的生防菌有不少都得到了推廣利用,防治效果比較具有優(yōu)勢的如弱毒性青枯假單孢桿菌的使用、熒光假單孢桿菌及芽孢桿菌的利用[12-13]。測定的生防菌的防效還不是很高,希望進(jìn)一步篩選獲得防效更高的生防菌。福建省農(nóng)科院培育出的青枯病生防菌ANTI-8098A對青枯病的控制效能較好[14]。本試驗(yàn)從作物根際土壤中分離得到300余種菌株,通過多次平板拮抗試驗(yàn),有3株拮抗菌室內(nèi)試驗(yàn)篩選中對青枯雷爾氏菌抑制效果較好,分別為Ab、A27、A38菌株。再使用對花生青枯病中抗的花生品種航花3號進(jìn)行進(jìn)一步的盆栽試驗(yàn)。拮抗菌株A38的防效顯著高于其他兩個菌株,防效達(dá)到52.71%。該菌株可進(jìn)一步用于花生青枯病菌的生物防治與利用。

        利用16SrRNA基因往往能進(jìn)行到屬水平的鑒定,但卻不能鑒定到種,往往還需要借助其他基因進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。喻國輝等[15]基于16SrRNA基因的測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹無法區(qū)分種間關(guān)系,而利用gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹則目的菌與Bacillus subtilis在同一個分支上,但無法區(qū)分與哪個變種的親緣關(guān)系比較近。王成義等[16]使用16SrRNA基因和recA基因擴(kuò)增香魚鰻利斯頓氏菌并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,認(rèn)為recA基因比16SrRNA基因更具有種間的分辨力。細(xì)菌的鑒定往往除了利用16SrRNA基因進(jìn)行,還需要輔以其他基因共同進(jìn)行,或者進(jìn)行生理生化的測試共同進(jìn)行。本研究利用16SrRNA和生理生化指標(biāo),將對花生青枯病有拮抗效果的A38菌株鑒定為綠膿假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。

        4 結(jié)論

        本研究篩選到一株對花生青枯病有較好拮抗作用的菌株A38,初步鑒定為綠膿假單胞桿菌。利用盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證該菌株的防治效果較好,達(dá)到52.72%。

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