陸 濟(jì)，游春平，董章勇

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】花生是世界上最主要的油料經(jīng)濟(jì)作物之一，是大部分非發(fā)達(dá)國家和地區(qū)人們的植物油和蛋白質(zhì)的主要來源，其營養(yǎng)價值極高。我國花生種植面積占所有油料作物種植總面積的1/4，總產(chǎn)量卻占全國油料作物總產(chǎn)量的50%以上，為我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展及貿(mào)易出口等作出了極其重要的貢獻(xiàn)［1］。細(xì)菌性青枯病是一種具有極大毀滅性的土傳病害，其病原為茄青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）［3-4］。青枯病是當(dāng)前世界發(fā)生范圍最廣、危害最大、引起損失最重的一種病害。由此造成的花生減產(chǎn)一般為10%～20%，嚴(yán)重時可高達(dá)70%，甚至絕收。在很多作物中尚未有有效的防治措施，因此該病害也被稱為植物的“癌癥”［4］。由于青枯菌在寄生范圍、致病能力、生化型等特性上存在很大差異，增加了這種病害的防治難度［3］。數(shù)十年來大量的研究者以不同的切入點(diǎn)對青枯菌進(jìn)行全面的研究探索，雖然取得了一定的進(jìn)展，但是未能解決生產(chǎn)上的問題。篩選花生青枯病的生物防治菌株對于該病原菌的防控有重要意義，尤其目前我國大力提倡農(nóng)藥減量的防控。【前人研究進(jìn)展】近些年來，青枯雷爾氏菌的生物防治越來越多地引起了國內(nèi)外專家學(xué)者的重視。目前已經(jīng)分離不同的潛在生防菌株，如青枯假單孢桿菌（Pseudomonas solanacarum Smith）［5］、鏈霉菌（Streptomycesspp.）［6］、假單胞桿菌（Pseudomonadaceae）［7］、芽孢桿菌（Bacillus）［8］和閘坡鏈霉菌（Streptomyces zhapoensis）［9］等。篩選到的生物防治菌株包括真菌、細(xì)菌和放線菌等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然前期開發(fā)了一些生防制劑，但普遍存在防效不穩(wěn)定的現(xiàn)象，因此希望開發(fā)出更多的生防制劑進(jìn)行替代和補(bǔ)充［10］?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選到對花生青枯病有較好拮抗作用的生物防治細(xì)菌菌株，并進(jìn)行鑒定，為該病的生物防治打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試花生青枯病致病菌株由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。供試培養(yǎng)基為改良的PDA培養(yǎng)基、TTC平板等培養(yǎng)基，其配置參照植物病原細(xì)胞研究技術(shù)［11］。盆栽試驗(yàn)花生品種為航花3號，由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鄭奕雄教授提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生青枯菌拮抗菌株的分離和純化 將采集自廣州市內(nèi)公園及仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院校園的土樣進(jìn)行風(fēng)干處理，將風(fēng)干的10 g植株根部土壤放入裝有90 mL無菌水的三角瓶中, 放入搖床以170 r/min振蕩30 min, 制成土壤懸浮液。經(jīng)過稀釋后涂NA平板，再放入28 ℃黑暗的恒溫箱中培養(yǎng),48 h后挑選出其中典型的單菌落, 經(jīng)平板劃線進(jìn)行純化, 并放入4°C冰箱保存待用。

1.2.2 花生青枯病拮抗菌的篩選 經(jīng)純化的菌株用點(diǎn)接法進(jìn)行初篩，操作過程如下: 將培養(yǎng)的青枯病菌懸液濃度稀釋為1×108CFU/mL, 從中取0.1 mL均勻地涂抹于NA平板上, 將滅菌后小圓片浸入土壤分離菌中，再放入涂有青枯病菌的平板中央。每個分離物重復(fù)3次。于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h后觀察拮抗效果。

1.2.3 拮抗菌發(fā)酵液對花生青枯病菌的抑制作用 將抑制效果較好的拮抗菌株接種到NB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下于170 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d，將發(fā)酵液在12 000 r/min下離心20 min, 取上清液，經(jīng)過濾滅菌，獲得無菌發(fā)酵液。將浸過無菌發(fā)酵液的圓片放入涂有青枯病菌的平板中央。每個拮抗菌株重復(fù)3次。于28℃下恒溫箱中培養(yǎng)48 h后觀察拮抗效果，計(jì)算抑制率。

1.2.4 拮抗菌的盆栽防治試驗(yàn) 盆栽防治試驗(yàn)使用4～5片葉子的苗期進(jìn)行試驗(yàn)。先用灌根法接種生防菌，48 h后再接青枯雷爾氏菌液，每種生防菌發(fā)酵液澆灌60株植株。以60株直接接種青枯雷爾氏菌液（1.0×108CFU/mL）20 mL作為對照，每個處理3次重復(fù)。接種青枯雷爾氏菌液3 d后開始記錄花生植株的生長和發(fā)病情況，持續(xù)觀察30 d。計(jì)算病株率和防治效果。

1.2.5 拮抗菌A38的鑒定 菌株總DNA提取利用東盛生物的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒進(jìn)行。PCR擴(kuò)增引物使用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F/1492R（White等, 1990）。將擴(kuò)增產(chǎn)物送交上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序，測序得到的結(jié)果在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）上進(jìn)行比對分析。使用軟件MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis，Version6.0）進(jìn)行序列比較，采用Kimura 2-parameter（Kimura-2參數(shù)）模型，采用neighbor joining 程序，boot strap 為1 000次。菌株的生理生化性狀參照《伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊》（第2版）和《常見細(xì)菌鑒定手冊》。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生青枯菌拮抗菌發(fā)酵液對花生青枯病菌的抑制作用

采用平板稀釋法從植物根際土壤中分離出300余株形態(tài)和顏色不同的細(xì)菌菌株，對這些菌株進(jìn)行花生青枯菌拮抗試驗(yàn)。結(jié)果表明，對青枯雷爾氏菌有拮抗作用的菌株有7株，約占總菌株數(shù)的1.8%左右，抑菌圈直徑范圍為5.0～16.0 mm，菌株為Aa、Ab、Af、Ai、A9、A27 和A38，其中A38菌株對花生青枯菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為16.0 mm，其次為Ab和A27菌株，抑菌圈直徑分別為11.5 mm和13.5 mm（表1）。

表1 拮抗菌株對青枯雷爾氏菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of antagonistic bacterial strains on R. solanacearum

2.2 拮抗菌株無菌濾液對青枯雷爾氏菌的抑制作用

選擇抑菌圈直徑大于10.0 mm的3個菌株Ab、A27和A38的無細(xì)胞發(fā)酵液進(jìn)行抑菌測定，結(jié)果顯示，3個菌株Ab、A27和A38的無細(xì)胞發(fā)酵液對青枯病菌都有明顯的抑制作用，抑制圈直徑分別為9.5、10.5、15.0 mm，差異極顯著，表明3株細(xì)菌的胞外分泌物對青枯雷爾氏菌起拮抗作用。

2.3 生防菌盆栽防治效果

利用前期在平板拮抗試驗(yàn)中對花生青枯菌有較好拮抗作用的3個菌株進(jìn)行盆栽防治試驗(yàn)，結(jié)果（表2）表明，拮抗菌Ab、A27和A38對花生青枯病均具有一定的防治效果，防治效果分別為12.16%、25.66%和52.71%，以A38菌株的防治效果較好，此防效有一定的研究價值，可進(jìn)一步進(jìn)行大田試驗(yàn)。

表2 拮抗細(xì)菌對花生青枯菌的溫室盆栽防治效果Table 2 Control effects of antagonistic bacteria on bacterial wilt of peanuts in greenhouse

2.4 A38菌株的鑒定

利用通用引物 27F/1492R 對生防菌A38的16S rRNA 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得大小為1 435 bp 產(chǎn)物，并與 GenBank 上序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，與菌株A38 16S rDN A序列相似性99%的細(xì)菌只有Pseudomonas aeruginosa。

菌株A38在NA培養(yǎng)基上的菌落為圓形，其顏色乳白不透明，表面有光澤、粘稠狀、微隆起、邊緣光滑、整齊、波狀，在革蘭氏染色中為陰性。

根據(jù)上述基因序列分析結(jié)果，參照《伯杰氏系統(tǒng)鑒定手冊》（第2版）選擇19項(xiàng)生理生化性狀進(jìn)行測定，結(jié)果(表3）顯示，菌株A38不僅能對部分糖或醇如木糖、核糖、半乳糖和葡萄糖等都能進(jìn)行有效的利用，并且菌株A38能使明膠液化，但不能進(jìn)行反硝化作用，能在42℃下生長，但卻不能在8.5%NaCl下生長。生理生化特征測定結(jié)果也表明A38菌株的特性與綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）的特性相似，相似性達(dá)78.95%。

表3 生防菌A38的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of biocontrol bacterium A38

3 討論

國內(nèi)外篩選出的生防菌有不少都得到了推廣利用，防治效果比較具有優(yōu)勢的如弱毒性青枯假單孢桿菌的使用、熒光假單孢桿菌及芽孢桿菌的利用［12-13］。測定的生防菌的防效還不是很高，希望進(jìn)一步篩選獲得防效更高的生防菌。福建省農(nóng)科院培育出的青枯病生防菌ANTI-8098A對青枯病的控制效能較好［14］。本試驗(yàn)從作物根際土壤中分離得到300余種菌株，通過多次平板拮抗試驗(yàn)，有3株拮抗菌室內(nèi)試驗(yàn)篩選中對青枯雷爾氏菌抑制效果較好，分別為Ab、A27、A38菌株。再使用對花生青枯病中抗的花生品種航花3號進(jìn)行進(jìn)一步的盆栽試驗(yàn)。拮抗菌株A38的防效顯著高于其他兩個菌株，防效達(dá)到52.71%。該菌株可進(jìn)一步用于花生青枯病菌的生物防治與利用。

利用16SrRNA基因往往能進(jìn)行到屬水平的鑒定，但卻不能鑒定到種，往往還需要借助其他基因進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。喻國輝等［15］基于16SrRNA基因的測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹無法區(qū)分種間關(guān)系，而利用gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹則目的菌與Bacillus subtilis在同一個分支上，但無法區(qū)分與哪個變種的親緣關(guān)系比較近。王成義等［16］使用16SrRNA基因和recA基因擴(kuò)增香魚鰻利斯頓氏菌并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，認(rèn)為recA基因比16SrRNA基因更具有種間的分辨力。細(xì)菌的鑒定往往除了利用16SrRNA基因進(jìn)行，還需要輔以其他基因共同進(jìn)行，或者進(jìn)行生理生化的測試共同進(jìn)行。本研究利用16SrRNA和生理生化指標(biāo)，將對花生青枯病有拮抗效果的A38菌株鑒定為綠膿假單胞桿菌（Pseudomonas aeruginosa）。

4 結(jié)論

本研究篩選到一株對花生青枯病有較好拮抗作用的菌株A38，初步鑒定為綠膿假單胞桿菌。利用盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證該菌株的防治效果較好，達(dá)到52.72%。