付 暉，李 想，韓 蓓，王雪莉，姚 瑛，胡 琴，張 喆

(北京市藥品檢驗所， 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206)

在藥品質(zhì)量標準研究制定的過程中，方法學驗證能夠考查所建立的質(zhì)量控制方法的可靠性和有效性[1]；對方法不確定度的研究能夠找到實驗過程中影響實驗的關鍵因素[2-5]。二者相結合，可以更全面地對所建立的方法進行驗證與考量。容量分析具有簡便、快捷的特點，可用于測定多種物質(zhì)的含量，并且有足夠的準確度，因而廣泛應用于醫(yī)院制劑的分析檢驗中。絡合滴定法是以絡合反應為基礎的容量分析方法。其中，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)滴定法的應用最為廣泛。復方鉀鈣鎂溶液用于心臟直視手術前的心臟停搏，復方制劑中的鉀、鈣與鎂可以通過阻滯鈉的內(nèi)流誘導心肌細胞膜過度極化，從而導致心臟停搏，制劑中各組分的含量是藥物的關鍵質(zhì)量屬性[6]。本研究對絡合滴定法測定復方鉀鈣鎂溶液中氯化鈣含量測定的方法進行方法學驗證與不確定度分析。采用EDTA滴定液0.05 mol/L滴定樣品中氯化鈣的含量，驗證方法的準確度、精密度、范圍與線性；通過繪制樣品的分析測定流程圖，確定不確定度的來源，計算方法的不確定度。本研究可為復方鉀鈣鎂溶液及其同類產(chǎn)品的質(zhì)量控制與質(zhì)量標準研究制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器

經(jīng)計量校準的10 ml(分度值0.05 ml)與50 ml(分度值0.1 ml)滴定管(天津玻璃廠)；Seven Compact型pH計，XA205型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 藥品與試劑

復方鉀鈣鎂溶液[中國醫(yī)學科學院阜外心血管病醫(yī)院，批號：G1701031，規(guī)格：10ml，含氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.38%～1.52%(g/ml)，含氯化鎂15.44%～17.06%(g/ml)，含鹽酸普魯卡因0.65%～0.71%(g/ml)，含氯化鉀3.54%～3.91%(g/ml)，含氯化鈣為1.38%～1.52%(g/ml)]；氯化鈣(美國藥典標準品，批號：F0D153，純度：101.9%)，基準氧化鋅(北京化工廠，批號：20150327，純度：99.95%～100.05%)；氯化鎂、氯化鉀、EDTA、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、氨水、氯化銨、甲基紅、鉻黑T與鈣紫紅素均為分析純；實驗用水為純化水。

2 方法與結果

2.1 氯化鈣含量測定

精密量取樣品2 ml，加水10 ml，氫氧化鈉試液5 ml，鈣紫紅素指示劑約0.1 g，搖勻，用EDTA滴定液(0.05 mol/L)滴定至溶液由紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧兯{色。每1 ml的EDTA滴定液(0.05 mol/L)相當于7.351 mg的CaCl2·2H2O(測定過程中使用的滴定液實際濃度為0.050 06 mol/L)。

2.2 EDTA滴定液的標定

取于約800 ℃灼燒至恒質(zhì)量的基準氧化鋅0.12 g，精密稱定，加稀鹽酸3 ml使溶解，加水25 ml，加0.025%甲基紅的乙醇溶液1滴，滴加氨試液至溶液顯微黃色，加水25 ml與氨-氯化銨緩沖液(pH=10.0)10 ml，再加鉻黑T指示劑少量，用EDTA滴定液滴定至溶液由紫色變?yōu)榧兯{色，并將滴定的結果用空白試驗校正。每1 ml的EDTA滴定液(0.05 mol/L)相當于4.069 mg的氧化鋅。根據(jù)EDTA滴定液的消耗量與氧化鋅的取用量，算出EDTA滴定液的濃度。

2.3 回收率試驗

精密稱量氯化鈣0.023、0.029及0.035 g各3份，分別加空白液2 ml(其中含氯化鉀0.740 g、氯化鎂0.325 g與鹽酸普魯卡因0.014 g)和水8 ml，加氫氧化鈉試液5 ml，鈣紫紅素指示劑約0.1 g，用EDTA滴定液(0.05 mol/L)滴定至溶液由紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榧兯{色。

2.4 試液與指示劑

按《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)規(guī)定的方法配制[1]。

2.5 方法學驗證

絡合滴定法測定復方鉀鈣鎂溶液中氯化鈣含量的方法學驗證結果顯示[7]，氯化鈣濃度0.011 6～0.017 4 g/ml的范圍內(nèi)時，樣品消耗滴定液的體積與氯化鈣濃度呈良好的線性關系，線性方程為Y=272.07X(R=1.00)。方法的回收率在99.54%～100.10%之間,平均回收率為99.91%。取復方鉀鈣鎂溶液樣品，按“2.1”—“2.4”項下測定方法平行測定氯化鈣含量6份，滴定平均消耗滴定液4.10 ml，測定結果平均值為1.51%(g/ml)，方法的精密度為0.39%。

2.6 不確定度數(shù)學模型

2.6.1 氯化鈣的測定：按公式(1)計算氯化鈣的含量。公式(1)，X=(V1×T×C)/(V2×0.005×1 000)×100%。式中，V1(ml)為消耗滴定液體積；T為滴定度[氯化鉀的摩爾質(zhì)量(MCaCl2)為147.01]7.351 mg/ml；C(mol/L)為EDTA滴定液實際濃度；V2(ml)為樣品取樣體積；0.005(mol/L)為EDTA滴定液標準濃度；1 000為單位換算系數(shù)，將mg轉(zhuǎn)換為g。

2.6.2 EDTA滴定液的標定：按公式(2)計算的EDTA滴定液的濃度。公式(2)，C=(m×p×1 000)/[(V1-V0)×MZnO]×100%。式中：m(g)為氧化鋅取樣量；P(%)為氧化鋅純度；V1(ml)為樣品消耗滴定液體積；V0(ml)為空白消耗滴定液體積；MZnO(g/mol)為氧化鋅摩爾質(zhì)量為81.38；1 000為單位換算系數(shù)，將ml轉(zhuǎn)換為L。

2.7 不確定度來源的識別

計算公式(1)中所包含的主要參數(shù)為消耗滴定液體積(V1)、滴定液實際濃度(C)、樣品的取樣體積(V2)、CaCl2的摩爾質(zhì)量(M)與實驗操作的重復性(R)。在不確定度計算過程中，滴定液實際濃度(C)的相對標準不確定度計算需包含公式(2)中的主要參數(shù)。方法的回收率(F)帶來的的影響也應作為分量引入。不確定度來源因果分析圖見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖Fig 1 Analysis chart of the source of uncertainty

2.8 不確定度的量化

表1 氯化鈣的原子量及其不確定度Tab 1 Atomic weight and its uncertainty of calcium chloride

2.8.6 EDTA滴定液實際濃度引入的相對標準不確定度U(C)：計算公式(2)中所包含的主要參數(shù)為稱取氧化鋅(m)、氧化鋅純度(P)、消耗滴定液體積(V1)、氧化鋅的摩爾質(zhì)量(M)與實驗操作的重復性(R)。實驗重復標定EDTA滴定液8次，平均消耗滴定液體積為29.54 ml，最終標定結果為0.050 06 mol/L，標準偏差為0.000 014 08 mol/L。

(5)空白消耗滴定液體積：空白結果為0 ml，忽略該項。

表2 氧化鋅的原子量及其不確定度Tab 2 Atomic weight and its uncertainty of zinc oxide

表3 不確定度來源及結果分析Tab 3 Analysis on the sources and results of uncertainty

3 討論

本品為復方鉀鈣鎂溶液，采用絡合滴定法測定供試品中氯化鈣與氯化鎂的含量，需要先控制供試品溶液的pH>12.5，先以Mg(OH)2沉淀掩蔽法測定鈣的含量。然后在pH≈10的條件下，測定鈣、鎂的總量，通過差減法計算鎂的含量。在pH>12.5的條件下，一方面滴定的配位反應的副反應系數(shù)較小，另一方面可以保證Mg(OH)2沉淀完全[15]。有觀點認為，Mg(OH)2沉淀的吸附作用會給鈣的測定帶來誤差，而這種誤差又會傳遞到鎂上[16-17]。鑒于此，本研究對采用絡合滴定法測定氯化鎂的含量測定方法進行了方法學驗證。

本研究中，當氯化鎂質(zhì)量濃度在0.130 0～0.195 0 g/ml的范圍內(nèi)時，樣品消耗滴定液的體積與氯化鎂濃度呈良好的線性關系，方法的回收率在99.58%～100.1%之間, 平均回收率為99.82%，方法的精密度為0.26%，采用絡合滴定法可以準確測定復方鉀鈣鎂溶液中氯化鈣與氯化鎂的含量。由不確定度評定結果可知，滴定液消耗體積的不確定度分量是最大的。方法消耗滴定液體積為4.10 ml，適量增加樣品取樣量，或者適量減小滴定液的濃度，從而增加消耗滴定液的體積，可以減小方法的不確定度。

總之，采用絡合滴定法測定復方鉀鈣鎂溶液中氯化鈣的含量，該方法有良好的準確度與精密度；復方鉀鈣鎂溶液中氯化鈣的質(zhì)量分數(shù)為1.51%，其擴展的不確定度為0.027 4%(k=2)；方法的不確定度主要來源于消耗滴定液的體積數(shù)量，適量增加樣品取樣量，或者適量減小滴定液的濃度，從而增加消耗滴定液的體積，可以減小方法的不確定度。本研究可以為復方鉀鈣鎂溶液及其同類產(chǎn)品含量測定的質(zhì)量標準制定提供參考。