徐林林，王 鏡，劉 園，劉 肖，袁海龍

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004； 2.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142)

塞來(lái)昔布(celecoxib，CB)是非甾體抗炎藥，能特異性抑制環(huán)氧酶2(COX-2)的產(chǎn)生，臨床多用于骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[1-2]。此外，CB在臨床術(shù)后鎮(zhèn)痛方面也有較多研究[3-5]。但CB為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)Ⅱ類藥物，水溶性差，溶出度低，應(yīng)用受到了極大的限制[6-7]。納米混懸劑(nanosuspensions，NS)是采用少量表面活性劑或聚合物穩(wěn)定的“純藥物”顆粒所構(gòu)成的一種亞微米膠體分散體系，可顯著增加難溶性藥物的溶出和吸收，提高其生物利用度[8-9]。為提高CB的溶出度，本研究采用微型化介質(zhì)研磨法(miniaturization media milling technique，MMMT)制備CB的NS(CB-NS)。MMMT裝置簡(jiǎn)單易得，且一次制備僅需要幾十毫克原料藥，可有效節(jié)約科研成本[10-11]。

1 材料

1.1 儀器

DF101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(北京恒豐長(zhǎng)偉科技有限公司)；氧化鋯珠子(直徑：0.4～0.6 mm，長(zhǎng)沙華尊陶瓷材料公司)；Winner 802型納米激光粒度儀(濟(jì)南微納有限公司)；ZRS-8G型智能溶出試驗(yàn)儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)；1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.2 藥品與試劑

CB原料藥(批號(hào)：28183-348520)由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供；聚維酮 K30(PVP K30)由安徽山河藥用輔料公司提供；十二烷基硫酸鈉(SDS，購(gòu)于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉及無(wú)水乙醇均購(gòu)自北京化工廠；甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 CB-NS的制備

稱取PVP K30 10.00 mg、SDS 1.00 mg和CB原料藥40.00 mg置于體積為10 ml的西林瓶中，依次加入適當(dāng)大小的磁力攪拌子、一定量的氧化鋯珠子及蒸餾水4.0 ml，在磁力攪拌器子帶動(dòng)氧化鋯珠子的研磨作用下，制備CB-NS。

2.2 CB-NS的粒徑分布及穩(wěn)定系數(shù)的測(cè)定

2.2.1 CB-NS的粒徑分析：取一定體積的CB-NS，蒸餾水稀釋后，用納米激光粒度儀測(cè)定CB-NS的粒徑(PS)和多分散度系數(shù)(PDI)，重復(fù)3次。

2.2.2 CB-NS穩(wěn)定性系數(shù)測(cè)定：取CB-NS 1.5 ml置于2.0 ml EP管中，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心30 min[12]；取上層混懸液適量，蒸餾水稀釋后，測(cè)定其粒徑，重復(fù)3次。采用以下公式計(jì)算：穩(wěn)定系數(shù)(SI)=離心后的PS/離心前的PS。

2.3 CB-NS工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化CB-NS工藝：在參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[12-13]，選擇對(duì)CB-NS影響顯著的3個(gè)因素，即ZrO2的用量(X1)、研磨速度(X2)和研磨時(shí)間(X3)進(jìn)行優(yōu)化研究。以PS(Y1，最小值為優(yōu))、PDI(Y2，最小值為優(yōu))、SI(Y3，接近1為優(yōu))為響應(yīng)值，采用3因素3水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化CB-NS工藝。因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Tab 1 Factor level table of Box-Behnken design

表2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of Box-Behnken design

2.3.2 模型擬合：采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行二項(xiàng)式方程擬合，并進(jìn)行各因素對(duì)Y1、Y2及Y3的相關(guān)性分析?；貧w系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。刪除對(duì)指標(biāo)無(wú)顯著性影響的項(xiàng)，得到的回歸方程分別為Y1=883.1-81.088X1-61.431X3+7.313×10-5X22；Y2=0.530-0.027X1-0.017X3；Y3=-0.468+0.314X1+0.039X3-6.961X22。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Tab 3 Significance test of regression equation coefficient

注：“—”表示該項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)

Note：“—” means there is no data

2.3.3 工藝參數(shù)優(yōu)化與預(yù)測(cè)：根據(jù)回歸方程，繪制以PS、PDI和SI對(duì)自變量的三維效應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1(A)和圖1(B)可知，CB-NS的PS和PDI隨著ZrO2用量的增大和研磨時(shí)間的增加都顯著減小，其中ZrO2用量的影響更為顯著；由圖1(C)和圖1(D)可知，隨著ZrO2用量的增大和研磨時(shí)間的增加，CB-NS的SI先快速增加后緩慢增加，其中ZrO2用量的影響也更為顯著。

2.3.4 工藝驗(yàn)證：采用Design-Expert 8.0.6實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，按Y1、Y2最小，Y3接近1設(shè)定目標(biāo)，得到的最優(yōu)工藝條件為X1=5.0 ml，X2=1 300 r/min，X3=8.0 h。模型對(duì)各指標(biāo)的預(yù)測(cè)值Y1、Y2和Y3分別為305 nm、0.276、0.740。依據(jù)該工藝制備3批CB-NS，測(cè)定各響應(yīng)指標(biāo)。實(shí)際測(cè)量值分別(307±10) nm、0.281±0.013和0.717±0.041。結(jié)果顯示，實(shí)際測(cè)量值與模型預(yù)測(cè)值接近，表明該模型的預(yù)測(cè)性良好。

2.4 CB-NS掃描電鏡(SEM)觀察

取最優(yōu)工藝制備的CB-NS適量，蒸餾水適當(dāng)稀釋，滴于錫箔紙上，常溫條件下放置，揮干，噴金處理后，于SEM下觀察其形態(tài)[14]。由結(jié)果(圖2)可知，CB原料藥大小不均勻，呈較大的針狀或長(zhǎng)片狀；而CB的納米粒呈不規(guī)則顆粒狀，粒徑多在300 nm左右。

2.5 X-射線衍射(XRD)分析：

取制得的CB-NS適量，平鋪于玻璃板上，真空干燥12 h后，收集干燥粉末。分別將上述CB-NS干燥粉末、CB原料藥、PVP K30、SDS及物理混合物(physical mixture，PM)進(jìn)行XRD分析。由結(jié)果(圖3)可知，與CB原料藥相比，PM和CB-NS干粉中CB的特征衍射峰均有一定程度減弱，且CB-NS干粉減弱程度最明顯，僅剩下2個(gè)明顯的衍射峰。以上結(jié)果表明在制備為CB-NS后，CB的結(jié)晶度有一定程度減弱。

2.6 CB-NS體外溶出考察

2.6.1 色譜條件：Shodex Silica C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(V∶V=70∶30)；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1.0 ml/min；柱溫27 ℃；進(jìn)樣量10 μl[13]。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取CB原料藥11.0 mg，用無(wú)水乙醇配制為質(zhì)量濃度440 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，再稀釋為1.76、4.40、7.04及8.80 μg/ml的對(duì)照品溶液，以峰對(duì)面積(Y)對(duì)CB質(zhì)量濃度(X，μg/ml)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

Y=153.19X-2.663 3(R2=0.999 9)，表明CB在1.76～8.80 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各因素與響應(yīng)值的三維圖Fig 1 Three-dimensional diagram of each factor and its response value

A.CB原料藥；B.CB-NSA. bulk drug of CB; B. CB-NS圖2 SEM圖Fig 2 SEM graph

A.PVP K30；B.SDS；C.PM；D.CB-NS干粉；E.CB原料藥A. PVP K30; B. SDS; C. PM; D. CB-NS powder; E. bulk drug of CB圖3 XRD圖Fig 3 XRD graph

2.6.3 體外溶出測(cè)定：參照《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2015年版)“通則0931”第二法，分別取CB-NS、PM混懸液及CB原料藥混懸液(樣品中CB含量均約為10 mg)，以0.5% SDS的磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)900 ml為溶出介質(zhì)[13]，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為(37±0.5)℃，分別于0.5、2、5、10、30、60、120及180 min取樣1.0 ml，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾(同時(shí)補(bǔ)充等溫、等體積的溶出介質(zhì))，續(xù)濾液經(jīng)高效液相色譜分析，計(jì)算藥物的體外累積溶出度，平行3次。

由結(jié)果(圖4)可知，CB-NS在0.5 min時(shí)，藥物的體外累積溶出度達(dá)到了(95.23±4.08)%，而原料藥和物理混合物的混懸液在60 min內(nèi)的體外累積溶出度還不到90%，表明將CB制成CB-NS，能顯著提高其體外溶出度。

圖4 體外累積溶出度曲線(n=3)Fig 4 Accumulative vitro dissolution curve (n=3)

3 討論

研究中發(fā)現(xiàn)，參照文獻(xiàn)中的方法，將PVP K30和SDS聯(lián)合使用，作為CB-NS的穩(wěn)定劑時(shí)，效果較好[15]。因此未對(duì)穩(wěn)定劑的種類進(jìn)行篩選。CB-NS干燥粉末的SEM結(jié)果顯示，多數(shù)CB納米粒的粒徑在300 nm左右，但也可見(jiàn)少數(shù)粒徑>500 nm的顆粒。原因可能是未加入干燥保護(hù)劑，CB-NS在干燥過(guò)程中發(fā)生了一定程度的聚集[16]。體外溶出試驗(yàn)中，CB-NS的累積溶出度很快接近100%，而物理混合物和原料藥兩者的累積溶出度無(wú)顯著差異，且均明顯低于CB-NS。以上結(jié)果表明，增加溶出度的主要原因是微型化介質(zhì)研磨法使CB原料藥納米化的作用，而非穩(wěn)定劑中SDS的增溶作用。