賈珊珊，吳嘉瑞，周 唯，郭思宇，張景媛，劉殊羽，孟子琦，倪夢蔚

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院， 北京 102488)

藏藥仁青芒覺成方于公元8世紀(jì)，始載于藏醫(yī)古典巨著《四部醫(yī)典》，書中記載：“中毒者特效芒覺也”，被譽(yù)為“解毒仙丹”，詳載于司徒·卻吉瓊乃(公元1700—1774年)所著《盤德瓊乃》[1]。后經(jīng)歷代藏醫(yī)學(xué)者不斷研究發(fā)展，由佐臺(tái)、珍珠、珊瑚、牛黃、熊膽、西紅花和檀香等多味藥物進(jìn)行炮制加工而成膠囊，仁青芒覺膠囊氣香，味苦、澀，具有清熱解毒、益肝養(yǎng)胃、愈瘡明目醒神和滋補(bǔ)強(qiáng)身等功效[2]。已有研究結(jié)果表明，仁青芒覺膠囊對慢性胃炎、心律失常和消化道潰瘍等有治療作用[2-4]。近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式發(fā)生改變，生活水平逐漸提高，代謝性疾病的發(fā)病率逐年攀高，嚴(yán)重影響了人們的生活并制約了社會(huì)發(fā)展，已上升為重要的公共衛(wèi)生問題。但是，代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，仍未被完全闡明[5]。代謝性疾病是眾多慢性、多基因復(fù)雜性疾病的共同病理基礎(chǔ)和(或)高危因素[6]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，利用生物分子網(wǎng)絡(luò)分析方法，選取特定節(jié)點(diǎn)進(jìn)行新藥設(shè)計(jì)和靶點(diǎn)分析的藥理學(xué)分支學(xué)科[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破了傳統(tǒng)的“一個(gè)基因一個(gè)藥物一個(gè)疾病”的理念，從整體的角度探索藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性，代表了現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究的哲學(xué)理念與研究模式的轉(zhuǎn)變[8-9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)為復(fù)雜成分藥物治療疾病的機(jī)制的系統(tǒng)研究提供了新的思路和視角。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析和預(yù)測仁青芒覺膠囊治療代謝性疾病的作用機(jī)制，以期為揭示仁青芒覺膠囊治療代謝性疾病作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 資料與方法

1.1 仁青芒覺的化學(xué)成分

依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/load_intro.php?id=43)，檢索仁青芒覺方中西紅花、牛黃、商陸、馬錢子、骨碎補(bǔ)、肉豆蔻、豆蔻、草果、余甘子、訶子、海金沙和檀香等12味藥物的所有化學(xué)成分，共搜集到734個(gè)化合物，其中西紅花70個(gè)，牛黃19個(gè)，商陸59個(gè)，馬錢子62個(gè)，骨碎補(bǔ)71個(gè)，肉豆蔻64個(gè)，豆蔻71個(gè)，草果59個(gè)，余甘子92個(gè)，訶子41個(gè)，海金沙56個(gè)，檀香70個(gè)。

1.2 閾值篩選

口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是藥物吸收、分布、代謝和排泄特性中最重要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)之一，表示經(jīng)口服的藥物到達(dá)血液循環(huán)系統(tǒng)所占口服劑量的比例，高的OB通常是決定生物活性分子(即有藥效作用的分子)類藥性(drug-likeness，DL)的關(guān)鍵指標(biāo)[10]。為了使篩選的化學(xué)成分更具有代表性，同時(shí)使所篩選出的化合物能夠全面反映仁青芒覺的藥理學(xué)數(shù)據(jù)性質(zhì)，本研究中所有藥物的化合物篩選閾值均為OB≥40%，DL≥0.18。通過篩選，734個(gè)化合物中有59個(gè)符合條件，將其作為候選化合物。

1.3 疾病靶點(diǎn)的查找

通過治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，檢索代謝性疾病中糖尿病、高尿酸血癥和高脂血癥等3種疾病的靶點(diǎn)。共檢索出254個(gè)靶點(diǎn)，其中高脂血癥2個(gè)，高尿酸血癥3個(gè)，糖尿病(分為1型糖尿病、2型糖尿病、胰島素依賴型糖尿病和非胰島素依賴型糖尿病)靶點(diǎn)249個(gè)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了說明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將統(tǒng)計(jì)所得的代謝性疾病254個(gè)基因上傳至在線String 10.5軟件(http：//string-db.org)。String數(shù)據(jù)庫是一個(gè)儲(chǔ)存已知的和預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，包含蛋白質(zhì)間直接和間接的相互作用[11]。設(shè)定分值為高置信度0.7分，獲取蛋白相互作用信息，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件(http：//www.Cytoscape.org/)中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將仁青芒覺的藥物、化合物和相關(guān)靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，以探究仁青芒覺治療代謝性疾病相關(guān)疾病的藥理學(xué)作用機(jī)制。Cytoscape是一個(gè)開放源碼的生物信息分析軟件，其核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)是基因、蛋白質(zhì)或分子，而節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接則代表著這些生物分子之間的相互作用[12]。

1.6 篩選藥物靶點(diǎn)

通過Cytoscape軟件對疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)與“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，其交集即為藥物可能作用于疾病的靶點(diǎn)，所對應(yīng)的成分即為仁青芒覺可能的治療疾病的活性成分。合并共得到38個(gè)靶點(diǎn)，其中與高脂血癥、高尿酸血癥相關(guān)靶點(diǎn)各1個(gè)，其余均為糖尿病靶點(diǎn)。尋找所得靶點(diǎn)對應(yīng)的成分與藥物，通過Cytoscape軟件作圖。

1.7 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape 3.6.1軟件(http：//www.Cytoscape.org/)，將仁青芒覺與治療代謝性疾病相關(guān)的化合物和相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，以探究仁青芒覺的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.8 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

為了說明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，本研究采用David v6.7數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)對合并所得的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。David數(shù)據(jù)庫整合多種類別的數(shù)據(jù)庫資源，采用改進(jìn)的Fisher精確檢驗(yàn)算法對基因集進(jìn)行富集分析，提供富集分析結(jié)果的P和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)。通過Cytoscape繪制靶點(diǎn)-通路圖，并通過omicshare網(wǎng)站(http：//www.omicshare.com/)對KEGG通路富集分析中篩選出的信號(hào)通路構(gòu)建氣泡圖[13]。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

從仁青芒覺12味藥物734個(gè)化合物中得到了59個(gè)活性成分，其中4個(gè)來自于草果，8個(gè)來自于豆蔻，13個(gè)來自骨碎補(bǔ)，1個(gè)來自海金沙，6個(gè)來自訶子，8個(gè)來自馬錢子，2個(gè)來自牛黃，8個(gè)來自肉豆蔻，4個(gè)來自西紅花，13個(gè)來自余甘子，1個(gè)來自海金沙，1個(gè)來自檀香。

2.2 網(wǎng)絡(luò)仁青芒覺藥物與代謝性疾病疾病靶點(diǎn)的篩選

為了得到仁青芒覺作用與代謝性疾病相關(guān)靶點(diǎn)，本研究通過TCMSP查找藥物成分對應(yīng)靶點(diǎn)并通過TTD查找疾病相關(guān)靶點(diǎn)，其中TCMSP得到活性化合物藥物靶點(diǎn)共956個(gè)，TTD查得疾病靶點(diǎn)254個(gè)(其中高脂血癥靶點(diǎn)2個(gè)，高尿酸血癥3個(gè)，糖尿病靶點(diǎn)249個(gè))，將TTD查得疾病靶點(diǎn)通過String進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建(見圖1)；將所得到的所有一級(jí)蛋白與二級(jí)蛋白和藥物活性化合物對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行合并，取交集為藥物可能作用于代謝性疾病的靶點(diǎn)，其對應(yīng)的化合物便可能是作用于疾病的有效物質(zhì)。通過合并共得到靶點(diǎn)38個(gè)，其中高脂血癥相關(guān)靶點(diǎn)1個(gè)(HMGCR)；高尿酸血癥相關(guān)靶點(diǎn)1個(gè)(XDH)；糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)36個(gè)，分別為MGAM、MTTP、NR3C2、AKR1B1、DPP4、ADRA2C、COMT、ADRA1D、DRD1、HTR2A、HTR2C、PPARD、ADRB1、RAF1、PTGS2、PTGS1、TLR4、ESR1、PDGFRB、GSK3B、PPARA、SLC2A4、PPARG、PIK3CG、CASP8、NR3C1、IL6、IL1B、CXCL10、HSF1、PTPN1、TNF、CHUK、CD40LG、IL2和INSR。仁青芒覺膠囊“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，圖中菱形節(jié)點(diǎn)代表藥物，左側(cè)圓形節(jié)點(diǎn)代表化合物，右側(cè)圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。

圖1 TTD疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 PPI network of disease targets of TTD

圖2 仁青芒覺膠囊“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Drug-compound-target network of Renqingmangjue capsules

2.3 仁青芒覺作用于代謝性疾病的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

在TCMSP中查找合并得到的靶點(diǎn)及其對應(yīng)化合物，通過Cytoscape繪制“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。仁青芒覺作用于代謝性疾病的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)共包括84個(gè)節(jié)點(diǎn)(46個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，38個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和178條邊，其中，六邊形節(jié)點(diǎn)表示化合物分子，菱形點(diǎn)表示藥物與糖尿病有關(guān)靶點(diǎn)，三角形節(jié)點(diǎn)表示藥物與高尿酸血癥有關(guān)靶點(diǎn)，圓形節(jié)點(diǎn)表示藥物與高脂血癥有關(guān)靶點(diǎn)；每條邊則表示化合物分子與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，見圖3。度值越大的節(jié)點(diǎn)，半徑越大，仁青芒覺膠囊“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值高于平均值的化合物見表1。

圖3 仁青芒覺膠囊“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Compount-target network of Renqingmangjue capsules

2.4 GO富集KEGG與通路富集分析

利用David平臺(tái)的GO和PATHWAY富集分析功能，對仁青芒覺治療代謝性疾病相關(guān)疾病涉及的38個(gè)蛋白的功能進(jìn)行了研究。在GO富集分析中，根據(jù)FDR確定了17個(gè)GO條目(FDR<0.05，見表2、圖4)，其中，生物過程相關(guān)的條目15個(gè)，包括為對一氧化氮生物合成的正調(diào)控、對RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、對寒冷的反應(yīng)、對ERK1與ERK2串聯(lián)的正反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、對脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)和類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路等方面；分子功能相關(guān)的條目2個(gè)，為類固醇激素受體活性與藥物結(jié)合方面。在KEGG通路富集分析中，得到76條信號(hào)通路，根據(jù)FDR<0.05篩選出8條信號(hào)通路(見表3、圖4)，包括查加斯病、Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、胰島素抵抗、軍團(tuán)桿菌病、非酒精性脂肪肝、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和流行性感冒A，表明仁青芒覺的有效成分可能通過作用于上述信號(hào)通路來達(dá)到治療代謝性疾病相關(guān)疾病的目的。仁青芒覺膠囊與代謝性疾病相關(guān)的KEGG通路-靶點(diǎn)圖見圖5，圖中，外部的八邊形節(jié)點(diǎn)表示通路，內(nèi)部的圓形節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)。氣泡圖見圖6，氣泡越大說明通路富集的基因越多，顏色越深則P越高。

3 討論

本研究依托TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)及TTD疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，研究了仁青芒覺膠囊12種藥物中有效成分及其與代謝性疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并對其做化合物靶點(diǎn)圖與GO富集和KEGG通路富集分析，為仁青芒覺多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的治療機(jī)制研究提供了參考。

合并得到的靶點(diǎn)中，HMGCR在GWAS分析中被證實(shí)與冠心病和血脂代謝異常有關(guān)[14]，并被發(fā)現(xiàn)與膽固醇代謝也有著密切的聯(lián)系。針對膽固醇合成途徑，HMGCR作為限速酶，可催化內(nèi)源性膽固醇的合成[15]。但在“藥物-化合物-靶點(diǎn)”圖中，HMGCR的度值較低。XDH基因則在高尿酸血癥中扮演著重要的角色，抑制XDH-mRNA基因的表達(dá)，可以降低尿酸的形成[16]。推測仁青芒覺膠囊可能通過XDH的調(diào)節(jié)治療高尿酸血癥。祖克拉·肉孜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，靶點(diǎn)中度值較高的PPARG基因的4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)(rs1801282、rs1899951、rs2881654和rs2972162)位點(diǎn)變異與柯爾克孜族人2型糖尿病可能存在關(guān)聯(lián)[17]。同時(shí)，PPARG中多個(gè)位點(diǎn)也已被報(bào)道與脂質(zhì)、能量代謝穩(wěn)態(tài)變化、脂質(zhì)代謝型疾病、肥胖和炎癥反應(yīng)等生理或病理狀態(tài)相關(guān)[18]。此外，度值較高的ESR1可以通過增強(qiáng)胰島素的敏感性，改善糖脂代謝的紊亂，從而緩解胰島素抵抗，并可直接作用于胰島β細(xì)胞，防止其凋亡[19-20]。二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)基因rs2160927多態(tài)性TT基因型可能是2型糖尿病的易感基因，在等位基因、顯性遺傳模型下與2型糖尿病相關(guān)；DPP-4基因rs10930040多態(tài)性G等位基因攜帶可能是2型糖尿病的易感基因，在顯性遺傳模型下與2型糖尿病相關(guān)，且DPP-4抑制劑對2型糖尿病有顯著效果[20]。

表1 仁青芒覺膠囊“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值高于平均值的化合物Tab 1 Compounds with degree higher than the average in the compound-target network of Renqingmangjue capsules

表2 仁青芒覺膠囊與代謝性疾病相關(guān)的GO條目Tab 2 List of GO of Renqingmangjue capsules associated with metabolic disease

圖4 GO富集分析結(jié)果Fig 4 GO enrichment results

編號(hào)條目名稱基因數(shù)/個(gè)FDRhsa05142查加斯病“Chagas disease(American trypanosomiasis)”80.001 269hsa04620Toll樣受體信號(hào)通路“Toll-like receptor signaling pathway”80.001 444hsa04668腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路“TNF signaling pathway”80.001 539hsa04931胰島素抵抗“Insulin resistance”80.001 640hsa05134軍團(tuán)桿菌病“Legionellosis”60.010 790hsa04932非酒精性脂肪肝“Non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)”80.015 364hsa04660T細(xì)胞受體信號(hào)通路“T cell receptor signaling pathway”70.015 903hsa05164流行性感冒A“Influenza A”80.038 642

圖5 仁青芒覺膠囊與代謝性疾病相關(guān)的KEGG通路-靶點(diǎn)圖Fig 5 Pathway-target network of KEGG to Renqingmangjue capsules associated with metabolic disease

圖6 仁青芒覺膠囊與代謝性疾病相關(guān)的KEGG氣泡圖Fig 6 Bubble diagram of KEGG to Renqingmangjue capsules associated with metabolic disease

度值較高的化合物中，槲皮素能夠下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、JNK和P38的磷酸化，顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化；異鼠李素能通過下調(diào)過氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α的表達(dá)來抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，并通過激活MAPK信號(hào)通路與抑制絲氨酸/蘇氨酸激酶的磷酸化的協(xié)同作用，促進(jìn)3T3-LI脂肪細(xì)胞的脂肪分解[21]。沒食子基團(tuán)(epigallocatechin gallate，EGCG)的存在和多酚類物質(zhì)的聚合可以顯著提高對胰脂肪酶抑制的活性[22]。由此可推測，仁青芒覺膠囊可能是通過這些成分作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)，達(dá)到對代謝性疾病的治療作用。

GO功能富集發(fā)現(xiàn)，仁青芒覺治療代謝性疾病相關(guān)疾病可能主要通過對一氧化氮生物合成的正調(diào)控、對RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、對寒冷的反應(yīng)、對ERK1與ERK2串聯(lián)的正反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)、對脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、類固醇激素受體活性與藥物結(jié)合方面的調(diào)控。KEGG通路涉及查加斯病、Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、胰島素抵抗、軍團(tuán)桿菌病、非酒精性脂肪肝、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和流行性感冒A。這些通路之間存在很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，說明一個(gè)基因可能參與著代謝性疾病相關(guān)疾病的多條通路，而仁青芒覺膠囊對于代謝性疾病的治療也可能是通過對多條通路共同作用實(shí)現(xiàn)的。朱亞軍[23]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Toll樣受體能促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，低水平的炎性反應(yīng)是肥胖者和2型糖尿病的特征，因此，Toll樣受體與高脂血癥、胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)；其研究還發(fā)現(xiàn)，骨骼肌在機(jī)體能量代謝中也發(fā)揮了重要作用，作為胰島素的主要靶器官，其對胰島素的反應(yīng)性直接關(guān)系到糖脂代謝，另外，在肌細(xì)胞上也有大量Toll樣受體表達(dá)。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，肥胖、非酒精性脂肪肝及2型糖尿病與胰島素抵抗有著密不可分的聯(lián)系[24-25]。促炎細(xì)胞因子TNF-α可導(dǎo)致脂肪組織或系統(tǒng)性炎癥的產(chǎn)生，最終可能引起胰島素抵抗[25]。由此可見，通路之間存在一定的聯(lián)系。以此推測，仁青芒覺膠囊的有效成分可能通過作用于這些信號(hào)通路來達(dá)到治療疾病的目的。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對仁青芒覺膠囊多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行研究，研究結(jié)果初步驗(yàn)證了仁青芒覺治療代謝性疾病相關(guān)疾病的基本藥理學(xué)作用和相關(guān)機(jī)制，并為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。