劉 梅，湛 琦

（重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400011）

惡性腫瘤是當(dāng)前危害人 類健康的重大疾病。目前臨床上預(yù) 防和治療惡性腫瘤主 要以化學(xué)治療為主，但大部分化學(xué)治療藥物在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也嚴(yán)重?fù)p害正常細(xì)胞的功能。由于化學(xué)治療有較大的毒副作用，因此尋找新型高效低毒抗腫瘤藥物被全世界科研工作者廣泛關(guān)注。

多糖為一類由多羥基醛或多羥基酮通過糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物，廣泛存在于動(dòng)物、植 物、真菌以及微生物中，具有多種多樣的天然活性，如調(diào)節(jié)免疫［1］、降血糖［2］、抗腫瘤［3］等作用。

青果（Canarii Fructus）為橄欖科植物橄欖（Canarium album Raeusch.）的干燥成熟果實(shí)，其性味甘、酸、平，具有清熱解毒，利咽，生津的功效。 藥理研究表明，青果具有抗炎［4］、鎮(zhèn)痛［5］、抗氧化［6］以及抑制腫瘤細(xì)胞增殖［7］的作用。本研究 通過提取分離青果中的多糖類成分，發(fā)現(xiàn)其通過DEAE-瓊脂糖凝膠FF后的水部位蛋白多糖組分CFW具有體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用青果購 自四川新荷花中藥飲片 有限公司，人體乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人體肝癌細(xì)胞HepG2和人體胃癌細(xì)胞MGC-803購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；DPBS緩沖液、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、1%青-鏈霉素和0.25%胰蛋白酶購自 美國Gibco公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公 司，MT T試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)研究所，DEAE-瓊脂糖凝膠FF購自中國北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，3500Da透析袋購自中國上海源葉生物科技有限公司，無水乙醇、氯化鈉均購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國BioTek儀器有限公司），電子分析天平（日本島津），電熱恒溫水浴箱（上海精宏設(shè)備有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（成都蘇凈科學(xué)器材有限公司）。

2 研究方法

2.1 青果粗多糖的制備

提取流程。 取青果飲片，粉碎，加8倍量無水乙醇加熱回流提取4h，過濾；藥渣置于電熱鼓風(fēng)干燥箱，40℃烘干，加8倍量水煎煮3次，合并水煎液，過濾；除去殘?jiān)?，減壓濃縮至濃稠液，加入4倍量無水乙醇使醇含量達(dá)到80%，靜置過夜，去上清液收集沉淀，揮干，依次用無水乙醇，丙酮，乙醚洗滌，揮干，加水溶解后，冷凍干燥，即得青果粗多糖。

DEAE-瓊脂糖凝膠FF預(yù)處理。采用0.2mol/L的氫氧化鈉溶液清洗至無色，用蒸餾水洗至中性，再用0.1mol/L的鹽酸溶液清洗至無色，用蒸餾水洗至中性，蒸餾水配置成勻漿，減壓脫氣1h，直 至漿液沒有任何氣泡，裝柱（35mm×30cm），蒸餾水平衡過夜。

青果粗多糖的部位分離。稱取青果粗多糖5g溶于20mL的蒸餾水，4000×g離心5min；取上清液，玻璃棒引導(dǎo)沿著色譜柱壁緩緩加樣，用蒸餾水溶液洗脫。使用苯酚-硫酸法檢測洗脫液含糖部分，然后收集。3500Da透析袋用自來水流水透析24h，減壓濃縮，冷凍干燥，得到青果粗多糖洗 脫各組分CFW。

總多糖含量測定。精密稱取D-葡萄 糖20mg于250mL的容量瓶中，加去離子水至刻度，分別吸取0.4mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL，1.4 mL，1.6 mL及1.8 mL，以水補(bǔ)至2mL，然后 加入6%苯酚1.0mL 及濃硫酸5.0mL，搖勻，靜置20min，于490nm處測吸光度，以去離子水為空白，得標(biāo)準(zhǔn)曲 線。吸取待測溶液適量，按照上述步驟進(jìn)行操作，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其總多糖含量。

總蛋白含量測定。使用 Pierce BCA 蛋白定量分析試劑盒測定，按照試劑盒說明配制工作液，并配制1mg/mL的待測溶液。根據(jù)微孔板方案（樣品與工作液的比例為1：8），取3組樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線同法操作，得3組數(shù)據(jù)的平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總蛋白含量。

3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)期細(xì)胞用于MTT檢測。

CFW不同溶液配置。精密稱取CFW約2mg，置于滅菌EP管中，加入含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液。濃度為1000μg/mL，振搖混勻，4000×g離心5min，取上清液0.22μm無菌濾頭過濾除菌，然后對其稀釋，依次得到濃度為62.5μg/mL，125μg/mL ，250μ g/mL， 500μg/ mL的CFW溶液。

細(xì)胞增殖 抑制實(shí)驗(yàn)。采用MTT法檢測CFW對3種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，選取對數(shù)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化， 重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度約為5×104細(xì)胞/mL，以每孔100μL接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，加入200μL不同濃度的CF W、CF1、CF2、CF3溶液，每 組3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置加等 量的細(xì)胞培養(yǎng)液（多糖濃度為0）為對照組，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μL M TT溶液（25mg MTT溶于5mL MTT溶液中），細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4h，完全棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL Formazan溶解液，搖床上振搖15min，酶標(biāo)儀37℃測定每孔的吸光度值，檢測波長為570nm。抑制率計(jì)算公式如下。

用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s ）表示，多組間比較用單因素方差分析（One way ANOVA）進(jìn)行方差分析，Duncan post-hoc比較各組與對照組之間的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 青果水部位 多糖組分CFW

依次通過乙醇除脂、水提、醇沉得到青果粗多糖，得率為7.11%，性狀為淡黃色粉末，接著通過DEAE-瓊脂糖凝膠FF對青果粗多糖進(jìn)行部位分離，得到水部位CFW組分，CFW的得率為36.8%，CFW為白色粉末狀物質(zhì)。通過苯酚-硫酸法測定CFW中的總多糖，通過BCA法測定CFW中的總蛋白含量，結(jié)果顯示CFW中總糖含量為（80.43±1.99）%，總蛋白含量為（14.59±0.19）%，說明CFW為糖蛋白成分。

4.2 CFW對人體乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度的CFW作用于MCF-7細(xì)胞48h后，對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制見比較率如表1。CFW中62.5、125、250、500和1000μg/mL濃度組別的吸光度與對照組相比，均有極顯著性差異，說明有顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖的作用，62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、50μg/mL 0和1000μg/mL濃度組別的抑制率分別為（7.9±3.6）%、（15.0±4.2）%、（23.5±3.3）%、（34.6±4.0）%和（44.1±1.6）%，說明隨著CFW濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，CFW抑制MCF-7細(xì)胞增殖的作用與劑量呈依賴關(guān)系。

表 1 不同濃度的CFW對人體乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制比較（±s ，n=3）

表 1 不同濃度的CFW對人體乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制比較（±s ，n=3）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

組別 CFW（μg/ml） 吸光度570nm 抑制率（%）對照組 0 0.880±0.030 0 CFW組62.5 0.810±0.032△ 7.9±3.6 125 0.748±0.037△ 15.0±4.2 250 0.673±0.029△ 23.5±3.3 500 0.576±0.035△ 34.6±4.0 1000 0.492±0.014△ 44.1±1.6

4.3 CFW對人體胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的抑制作用。

不同濃度的CFW作用于MGC-803細(xì)胞48h后，對MGC-803細(xì)胞增殖的抑制比較見表2。與對照組比較，CFW中500μg/mL和1000μg/mL組的吸光度均有極顯著性差異，說明低劑量CFW沒有抑制MGC-803細(xì)胞增殖的作用，高劑量CFW有抑制MGC-803細(xì)胞增殖的作用，500和1000μg/ml濃度組別的 抑制率分別為（27.9±5.8）%和（43.8±3.4）%。

表2 不同濃度的CFW對人體胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的抑制比較（±s ，n=3）

表2 不同濃度的CFW對人體胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的抑制比較（±s ，n=3）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

組別 CFW（μg/ml） 吸光度570nm 抑制率（%）對照組 0 0.777±0.049 0 62.5 0.724±0.036 6.9±4.7 125 0.699±0.045 10.1±5.7 250 0.686±0.040 11.8±5.2 500 0.560±0.045△ 27.9±5.8 1000 0.437±0.027△ 43.8±3.4 CFW組

4.4 CFW對人體肝癌HepG2細(xì)胞增殖的作用

不同濃度的CFW作用于HepG2細(xì)胞48h后，對HepG2細(xì)胞增殖的抑制見表3。CFW中62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL組的吸光度與對照組相比，均有極顯著性差異，說明有顯著性抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用，62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL組別的抑制率分別為（18.8±5.2）%、（30.6±4.4）%、（42.6±2.8）%、（52.2±4.8）%和（58.8±2.5）%，說明隨著CFW濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，CFW抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用與劑量呈依賴關(guān)系。

表3 不同濃度的CFW對人體肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制比較（±s， n=3）

表3 不同濃度的CFW對人體肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制比較（±s， n=3）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

62.5 0.814±0.053△ 18.8±5.2 125 0.696±0.044△ 30.6±4.4 250 0.576±0.028△ 42.6±2.8 500 0.479±0.048△ 52.2±4.8 1000 0.412±0.025△ 58.8±2.5組別 CFW（μg/ml） 吸光度570nm 抑制率（%）對照組 0 1.003±0.085 0 CFW組

5 討 論

用乙醇除脂、水提、醇沉的方法從青果中提 取得到粗多糖和粗多糖復(fù)合物成分，進(jìn)一步利用DEAE-瓊脂糖凝膠FF離子交換色譜對提取得到的粗多糖和粗多糖復(fù)合物成分進(jìn)行部位分離，依次用蒸餾水，0.5mol/L氯化鈉、1.0mol/L氯化鈉和2.0mol/L氯化鈉溶液洗脫，得到CFW、CF1、CF2和CF3四個(gè)部位。在前期的實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)，CFW、CF1、CF2和CF3四個(gè)部位中，只有CFW具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性。因此本研究在3種人體腫瘤細(xì)胞模型上：人體乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人體肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞和人體胃癌細(xì)胞MGC-803。對CFW的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。

MTT學(xué)名為3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。MTT法是一種檢測細(xì)胞增殖和存活的方法，其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，在酶標(biāo)儀570nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。MTT法是國內(nèi)外檢測藥物的細(xì)胞毒性和抗腫瘤活性的常用方法。

近年來，多糖就其顯著的抗腫瘤活性和較低的毒副作用，逐漸得到國內(nèi)外科研工作者的關(guān)注。研究顯示，多糖主要通過直接和間接的方式發(fā)揮抗腫瘤活性：通過細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞周期等直接發(fā)揮抗腫瘤作用，例如枸杞多糖LBP通過誘導(dǎo)人體前列腺癌PC-3細(xì)胞的凋亡，從而抑制其增殖［8］；人參多糖通過將非小細(xì)胞肺癌A549腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，發(fā)揮抗腫瘤作用［9］；通過發(fā)揮機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用，通過宿主免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮抗腫瘤作用，例如桑黃多糖通過活性T細(xì)胞和B細(xì)胞，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［10］，蘆薈多糖PAC-1通過活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的攝取和吞噬作用，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤活性［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示青果水部位多糖組分CFW在體外對人體乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人體肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞和人體胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖有明顯抑制作用。因此可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制，繼續(xù)對CFW抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行研究，同時(shí)可以 檢測CFW在體內(nèi)的抗腫瘤活性，為從青果中開發(fā)具有抗腫瘤活性的藥物提供更多的參考。