潘黎，于曉雪，孟玉芳，程學(xué)放，李冰潔，盧思沛，代昕彤，李留安，金天明

HPLC法檢測雞蛋中DHA-EE和EPA-EE含量的條件優(yōu)化

潘黎，于曉雪通信作者，孟玉芳，程學(xué)放，李冰潔，盧思沛，代昕彤，李留安，金天明

（天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300384）

為利用高效液相色譜法檢測衍生化雞蛋樣品中的二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）和二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE），使用super C18色譜柱，考察了流動相有機(jī)相比例、流速及柱溫改變對EPA-EE和DHA-EE分離的影響，確定了等度洗脫、流動相為甲醇-水（95∶5，/）、流速1.0 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長220 nm的色譜條件。該方法下，EPA-EE和DHA-EE分別在線性范圍內(nèi)濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 2和0.999 0，采用上述方法測定了ω-溴苯乙酮衍生化的雞蛋中混合脂肪酸，結(jié)果表明EPA-EE和DHA-EE二峰可達(dá)到基線分離。本方法快速、簡單、重復(fù)性好，為雞蛋中多不飽和脂肪酸含量的快速檢測提供了思路。

高效液相色譜法；雞蛋；二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）；二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）

二十碳五烯酸（EPA）被譽(yù)為“血管清潔劑”，能夠調(diào)節(jié)血脂、降低血液黏稠度，預(yù)防血栓形成，還可以降血壓，保護(hù)心腦血管健康及腎臟功能。二十二碳六烯酸（DHA），俗稱“腦黃金”，是人腦的主要組成物質(zhì)之一，約占人腦脂質(zhì)的10%，近期也有研究表明DHA可改善心腦血管病和抑郁癥，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[1-4]。EPA和DHA都屬于ω-3 多不飽和脂肪酸，在人體內(nèi)的合成不能滿足自身需要，需由食物供給。雞蛋中含有較高的蛋白質(zhì)、脂類、多種氨基酸及礦物質(zhì)元素等，營養(yǎng)豐富且價格低，因此被世界各地的人們廣泛食用[5]。但普通雞蛋中DHA和EPA含量較少，當(dāng)前市場上通過各種添加劑生產(chǎn)的富含EPA和DHA的功能禽蛋產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，深受消費(fèi)者歡迎，因此迫切需要建立起測定雞蛋中EPA和DHA含量的快速有效方法[6-8]。

EPA 和DHA 不穩(wěn)定，最近研究顯示在保健品中其被制作為納米乳來提高穩(wěn)定性[9]。二者在自然界通常是以甘油三酯形態(tài)存在的，通過有機(jī)溶劑提取天然形態(tài)的甘油三酯型效率低下，且由于缺少商業(yè)化甘油三酯型EPA和甘油三酯型DHA標(biāo)準(zhǔn)品，因此通常采用乙酯化[10-11]。本試驗將用穩(wěn)定性更好的乙酯化形式——二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）和二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）來替代。目前雞蛋中多不飽和脂肪酸含量的檢測技術(shù)都采用氣相色譜法，對樣品的處理程序較復(fù)雜、耗時較長[12-14]。

本試驗擬比較流動相、流速、柱溫等條件改變對EPA-EE和DHA-EE分離效果的影響，并檢測方法的精密度、重復(fù)性及樣品回收率，為建立簡單、快速、準(zhǔn)確地檢測雞蛋中多不飽和脂肪酸含量的高效液相色譜法提供試驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent1260 HPLC高效液相色譜儀（美國，Agilent公司）；ACE Super C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，50 mm×4.6 mm保護(hù)柱，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)（默瑞（上海）生物科技有限公司）；分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司）；氮吹儀（美國，Organomation公司）。

1.1.2 ?試劑

二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）標(biāo)準(zhǔn)品、二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海安譜實(shí)驗科技股份有限公司；色譜級甲醇和乙腈，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；三乙胺（色譜級），購自上海安譜試驗科技股份有限公司；ω-溴代苯乙酮（分析純，瑪雅試劑）；丙酮（分析純）；三氯甲烷（分析純），購自利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司；無水乙醇（色譜純），購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氫氧化鉀，購自博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；純凈水，購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；氮?dú)猓浑p蒸水；0.22 μm濾膜及0.2 μm注射器過濾頭，天津市科億隆實(shí)驗設(shè)備有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、檢測限與定量限

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用色譜甲醇分別將 EPA-EE標(biāo)準(zhǔn)品和DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品配制成100 mg/mL的儲液，并梯度稀釋成100、200、400、800、1 000、1 500、2 000 μg/mL。將以上2個系列、7個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣。每個樣品精確進(jìn)樣20 μL，按選定色譜條件測定，采用峰面積對其濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 檢出限與定量限

將建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的EPA-EE標(biāo)準(zhǔn)品和DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，用于測定檢出限、定量限，當(dāng)信噪比（S/N）為3 時樣品濃度為檢出限；當(dāng)信噪比（S/N）為10 時樣品濃度為定量限。

1.3 流動相、流速、柱溫的選擇與優(yōu)化

在相同流速、柱溫條件下，考察不同比例甲醇-水（95%、90%）、乙腈-水（85%、90%、95%）作為流動相時，對EPA-EE和DHA-EE分離效果的影響；在相同流動相、流速條件下，考察了不同柱溫（30、35、40 ℃）對EPA-EE和DHA-EE分離效果的影響；在相同流動相、柱溫條件下，考察了不同流速（0.8、1.0、1.5 mL/min）對EPA-EE和DHA-EE分離效果的影響。

1.4 精密度、重復(fù)性、回收率試驗

分別取濃度均為2 000 μg/mL的EPA-EE 和DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器的精密度。

分別取EPA-EE 和DHA-EE 儲備液，配制濃度均為1 000 μg/mL的供試品溶液各6 份，精密吸取20 μL 進(jìn)樣進(jìn)行測定，分別計算EPA-EE和DHA-EE 的重復(fù)性。

取EPA-EE標(biāo)準(zhǔn)品27.32 μg加入到烘干蛋樣0.5 g中，另外取DHA -EE標(biāo)準(zhǔn)品303.92 μg加入烘干蛋樣0.5 g中，每組設(shè)6個重復(fù)，按照1.5中步驟進(jìn)行脂肪酸提取與酯化后，作為供試品溶液進(jìn)行測定，計算回收率。由于1.5步驟最終定容體積為2 mL，因此EPA-EE標(biāo)準(zhǔn)品的添加水平相當(dāng)于13.66 μg/ mL，DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品的添加水平相當(dāng)于151.96 μg/ mL。

1.5 雞蛋中脂肪酸的提取與酯化

新鮮雞蛋的蛋黃蛋清分離后，取蛋黃攪勻、烘干，精確稱取1 g，加入3 mL混合溶劑（氯仿：甲醇＝1∶2），攪拌2 min；加氯仿5 mL，攪拌30 s；加蒸餾水5 mL，攪拌30 s；抽濾，用少量氯仿洗滌殘渣；待濾液靜置分層，分離去除溶劑，得油層；加入4 mL 0.5 mol/L KOH-乙醇溶液，充氮?dú)夂笤?0 ℃水浴中加熱30 min；冷卻后加入1滴酚酞指示劑；HCL-乙醇滴定至終點(diǎn)；分離上清，氮?dú)獯蹈?。樣品加?.2 mL三乙胺的丙酮溶液（10 g/L）及0.4 mLω-溴苯乙酮溶液（10 g/L）；充入氮?dú)猓?0 ℃水浴加熱15 min；冷卻后定容至2 mL。所有樣品包括標(biāo)準(zhǔn)品，采用高效液相色譜法檢測都需經(jīng)0.2 μm注射器濾膜過濾后上樣。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的整理和計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇與優(yōu)化

相同流速、相同柱溫（1 mL/min、30 ℃）下，分別考察了以甲醇-水與乙腈-水為流動相時的分離效果，結(jié)果如圖1所示，使用乙腈-水（95∶5，/）、乙腈-水（90∶10，/）、乙腈-水（85∶15，/）和甲醇-水（95∶5，/）、甲醇-水（90∶10，/）的流動相時，EPA-EE和DHA-EE的峰都能達(dá)到基線分離，達(dá)到分析要求。

圖1 相同流速、相同柱溫、不同流動相下EPA-EE與DHA-EE的色譜圖譜

注：a. 乙腈-水（95∶5，/）；b. 乙腈-水（90∶10，/）；c. 乙腈-水（85∶15，/）；d. 甲醇-水（95∶5，/）；e. 甲醇-水（90∶10，/）

2.2 流速的選擇

使用甲醇-水（95∶5，/）為流動相，柱溫為30 ℃，分別檢測流速為1.0 mL/min和1.5 mL/min時EPA-EE和DHA-EE的分離情況。結(jié)果如圖2所示，2種流速下EPA-EE和DHA-EE都能完全達(dá)到基線分離，流速增加，柱壓也隨之增高，從101增加至15 200 KPa；樣品保留時間縮短，其中EPA-EE的保留時間由11.775 min縮短至7.895 min，DHA-EE的保留時間由13.893 min縮短至9.319 min?？紤]到保留時間、后續(xù)檢測雞蛋提取脂肪酸樣品雜質(zhì)等因素，流速定為1.0 mL/min。

圖2 流動相和柱溫不變，流速改變對EPA-EE和DHA-EE分離效果的影響

注：a. 流速為1.0 mL/min；b. 流速為1.5 mL/min

2.3 柱溫的選擇

使用甲醇-水（95∶5，/）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測柱溫為30、35、40 ℃時EPA-EE和DHA-EE的分離情況。結(jié)果如圖3所示，3種柱溫下EPA-EE和DHA-EE都能完全達(dá)到基線分離。隨著柱溫增加（30～40 ℃），EPA-EE和DHA-EE的保留時間均縮短1～2 min。考慮到保護(hù)脂肪酸樣品穩(wěn)定性等因素，柱溫定為30 ℃。

圖3 流動相和流速不變，柱溫改變對EPA-EE和DHA-EE分離效果的影響

注：a. 柱溫為30 ℃；b. 柱溫為35 ℃；c. 柱溫為40 ℃

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，檢出限與定量限

以甲醇-水（95:5，/）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測柱溫為30 ℃，每個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣20 μL測定后，采用峰面積對其濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，EPA-EE線性回歸方程為＝8.898 5- 3.959 4（為峰面積，為樣品濃度），2＝0.999 2。DHA-EE線性回歸方程為＝3.468 3＋186.620 0（為峰面積，為樣品濃度），2＝0.999 0。在各自濃度范圍內(nèi)，EPA-EE 和DHA-EE 的線性關(guān)系良好，而且線性范圍較寬。

逐級稀釋溶液測定檢出限、定量限，當(dāng)信噪比（S/N）為3 時，EPA-EE 和DHA-EE 的檢出限分別為10 ng 和12 ng。當(dāng)信噪比（S/N）為10 時，EPA-EE和DHA-EE 的定量限分別為44 ng 和46 ng。

表1 EPA-EE 和DHA-EE 標(biāo)準(zhǔn)品線性測定結(jié)果

成分濃度峰面積成分濃度峰面積 μg·mL-1μg·mL-1 EPA-EE1095.5DHA-EE100 427.3 20185.3200 844.9 40330.14001 656.8 80683.08003 081.9 100908.81 0003 642.3 1501 334.41 5005 390.6 2001 774.32 0007 072.5

2.5 精密度試驗

分別取濃度均為2 000 μg/mL的EPA-EE 和DHA-EE標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取20 μL進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器的精密度，EPA-EE和DHA-EE的峰面積分別為0.020%和0.018%，表明本方法的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

分別取EPA-EE 和DHA-EE 儲備液，配制濃度均為1 000 μg/mL的供試品溶液各6 份，精密吸取20 μL進(jìn)樣進(jìn)行測定，分別計算EPA-EE和DHA-EE 的重復(fù)性。結(jié)果顯示，EPA-EE 和DHA-EE 的重復(fù)性分別為4.32%和4.30%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗

經(jīng)過樣品前處理和高效液相色譜檢測，EPA-EE平均回收率為89.63%，為1.15%，DHA-EE平均回收率為85.61%，為1.85%，結(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明，本方法回收率良好。

表2 EPA-EE回收率測定結(jié)果

成分添加水平檢測水平回收率平均回收率RSD μg·mL-1μg·mL-1%%% EPA-EE13.6612.0087.8889.631.15 12.3890.60 12.2989.95 12.3989.87 12.2789.86 12.8594.10

表3 DHA-EE回收率測定結(jié)果

成分添加水平檢測水平回收率平均回收率RSD μg·mL-1μg·mL-1%%% DHA-EE151.96131.7986.7285.611.85 127.1783.69 130.1785.66 127.1183.65 132.4587.16 131.9086.80

2.8 衍生化雞蛋樣品中EPA-EE與DHA-EE檢測

對雞蛋樣品進(jìn)行提取脂肪酸和衍生化，采用流動相為甲醇-水（95∶5，/）等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長220 nm的方法測定。結(jié)果如圖4所示，該方法可以分離EPA-EE和DHA-EE的峰。

圖4 雞蛋樣品衍生化脂肪酸中EPA-EE和DHA-EE的檢測結(jié)果

3 討論

3.1 高效液相色譜條件的選擇和優(yōu)化

在研究制定一個高效液相色譜方法時，選擇適宜的流動相很重要[15]。根據(jù)參考文獻(xiàn)報道[16-18]，考察了甲醇-水和乙腈-水作為流動相時的分離效果，較高比例有機(jī)相都能使DHA-EE和EPA-EE分離，且峰形對稱性較好?？紤]到生物樣本的成分復(fù)雜性，選擇兩個峰保留時間間隔適中的甲醇-水（95∶5，/）進(jìn)行后續(xù)條件的進(jìn)一步優(yōu)化。

柱溫和流速改變對DHA-EE和EPA-EE的分離效果也有一定的影響，主要是隨著柱溫升高或流速變大，保留時間縮短，其中柱溫改變對柱壓影響不大，而流速變大使得柱壓變大。鑒于保護(hù)雞蛋脂肪酸樣品的穩(wěn)定性，本試驗使用了柱溫30 ℃、流速1.0 mL/min的條件。

3.2 雞蛋樣品的衍生化處理

EPA和DHA在魚油或雞蛋中通常是以甘油三酯形態(tài)存在的，通過有機(jī)溶劑提取天然形態(tài)的甘油三酯型效率較低。高效液相色譜法或氣相色譜法檢測脂肪酸時通常進(jìn)行甲酯化或乙酯化來提高其穩(wěn)定性，因此本試驗將雞蛋脂肪酸提取后，利用乙醇酯化樣品使其變?yōu)橐阴セ螒B(tài)進(jìn)行檢測[13, 19-21]。在檢測雞蛋樣品時，峰型尖銳度欠佳，需要進(jìn)一步試驗予以改善，例如調(diào)節(jié)流動相的pH值。

綜上所述，本試驗中使用等度洗脫、流動相為甲醇-水（95∶5，/）、流速1.0 mL/min、柱溫30 ℃、檢測波長220 nm的色譜條件，能夠快速穩(wěn)定測定出ω-溴苯乙酮衍生化的雞蛋樣品中的EPA-EE和DHA-EE，為進(jìn)一步優(yōu)化檢測方法提供了一定的基礎(chǔ)和依據(jù)。

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Optimization of determination condition of DHA-EE and EPA-EE in eggs by high performance liquid chromatography（HPLC）

PAN Li, YU Xiao-xueCorresponding Author, MENG Yu-fang, CHENG Xue-fang, LI Bing-jie, LU Si-pei, DAI Xin-tong, LI Liu-an, JIN Tian-ming

（Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To detect the content of ethyl eicosapentaenoate（EPA-EE）and ethyl docosahexaenoate（DHA-EE）in derived egg samples by high performance liquid chromatography（HPLC）, the super C18chromatographic column was used to investigate the effects of proportion of organic phase, flow rate and column temperature on separation of EPA-EE and DHA-EE. The optimal chromatographic conditions were determined: isocratic elution, mobile phase of methanol and water（95:5,/）, flow rate of 1.0 mL/min, column temperature 30℃, detection wave length of 220 nm. Through this method, the concentration and peak area of EPA-EE and DHA-EE showed a good linear relationship, and the correlation coefficient2were 0.999 2 and 0.999 0 respectively. And then the separate peaks of EPA-EE and DHA-EE in derived egg samples were detected. This method is rapid, simple and reproducible, and it provides ideas for the rapid detection of polyunsaturated fatty acids in eggs.

high performance liquid chromatography（HPLC）; eggs; ethyl eicosapentaenoate（EPA-EE）; ethyl docosahexaenoate（DHA-EE）

1008-5394（2019）04-0061-06

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.013

S879.3

A

2019-05-07

國家自然科學(xué)基金項目（31702223）；天津市大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201710061096）；天津市“131”創(chuàng)新型人才團(tuán)隊項目（20180318）；天津市科技重大專項與工程項目（18ZXBFNC00310）；天津市企業(yè)科技特派員項目（19JCTPJC59500）

潘黎（1995-），男，本科在讀，主要從事畜禽獸醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail：1240734652@qq.com。

于曉雪（1990-），女，講師，博士，主要從事畜禽獸醫(yī)學(xué)研究工作。E-mail：yuxiaoxue1990@163.com。

責(zé)任編輯：張愛婷