史卓琪，劉黎瑤，，通信作者，熊倩，王慶奎

毛蕊異黃酮-磷脂復合物的處方研究

史卓琪a，劉黎瑤a，b，通信作者，熊倩a，王慶奎b

（天津農(nóng)學院 a. 基礎科學學院 生物制藥系，b. 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

毛蕊異黃酮是從黃芪中提取分離得到的小分子異黃酮類活性化合物，可與機體的雌激素受體結合發(fā)揮顯著的雌激素樣作用、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。但由于其脂溶性差等問題，造成制劑成型性差，體內(nèi)生物利用度低。本研究旨在利用磷脂復合技術提高其脂溶性。其中，通過溶劑-旋轉蒸發(fā)法，以復合率（）為篩選指標，通過單因素篩選以及正交設計，篩選得到制備毛蕊異黃酮-磷脂復合物的最佳處方。優(yōu)選復合條件下，毛蕊異黃酮與大豆磷脂的復合比例為1∶5；復合溶劑為pH 6.0的無水乙醇；復合時間為60 min，在該優(yōu)選處方工藝下，毛蕊異黃酮-磷脂復合率達到90%以上，4 ℃下可穩(wěn)定保存3個月。該研究為毛蕊異黃酮-磷脂復合物的后期應用奠定了物質

毛蕊異黃酮；磷脂復合物；正交設計；處方篩選

毛蕊異黃酮是提取自中藥黃芩、黃芪中的單體活性成分，研究表明其可與機體的雌激素受體結合，發(fā)生雌激素樣作用，且具有顯著的抗氧化、降血糖、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[1-3]。但由于毛蕊異黃酮的極性大，脂溶性極差，導致口服給藥后的生物利用度較低，無法充分發(fā)揮藥物治療作用[4-5]。因此，通過藥物制劑技術構建適宜的遞送載體來提高毛蕊異黃酮的脂溶性，具有極大的應用前景和價值。

磷脂復合物是通過藥物和磷脂分子間的靜電復合作用形成的穩(wěn)定復合體，能夠在不改變藥物分子結構的前提下，極大程度提高藥物的脂溶性，在增加中藥有效成分口服生物利用度的研究方面已有較深入的研究[6-8]。已有研究將苦參總黃酮等植物黃酮類藥物與磷脂形成復合物后，能顯著增加藥物在醇溶液中的溶解度，提高在細胞膜中的溶解性，增加腸壁的通透性，從而提高藥物在腸道內(nèi)的吸收率[9]。但是，在已有研究中未見毛蕊異黃酮-磷脂復合物的處方研究。因此，在本研究中，使用溶劑-旋轉蒸發(fā)法，在適宜的復合溶劑中，通過單因素試驗以及正交設計，以毛蕊異黃酮與大豆卵磷脂的復合率為篩選指標，對復合溶劑的pH值、復合時間及投料比例進行了考察，在優(yōu)選的復合處方工藝中，復合溶劑為無水乙醇，溶劑系統(tǒng)的最適pH值為6.0，復合時間為60 min，毛蕊異黃酮與磷脂的投料質量比例為1∶5。按照優(yōu)選處方所制備的毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率達到90%以上。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（Sartorius，BSA 223S）；旋轉蒸發(fā)儀（Rotavapor R-100，BUCHI）；超聲波清洗儀（昆山禾創(chuàng)儀器有限公司，KH5200B型）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；微孔濾膜等。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度98%）；毛蕊異黃酮標準品（中國藥品生物制品檢定院，HPLC≥99%）；大豆磷脂（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司，純度98%）；無水乙醇、正己烷、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷（天津市風船化學試劑有限公司，分析純）；磷酸、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 毛蕊異黃酮-磷脂復合物的制備方法

分別稱取適量毛蕊異黃酮與大豆卵磷脂置于燒杯中，加入適宜溶劑分別溶解后，混合并振搖均勻，封口。置于震蕩條件下進行復合反應。復合結束后，減壓蒸發(fā)多余溶劑，即得干燥的黃色固體顆粒狀毛蕊異黃酮-磷脂復合物。

2.2 毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率測定方法建立

2.2.1 紫外-可見光區(qū)全波長掃描

稱取毛蕊異黃酮標準品10 mg置于容量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解并稀釋至適當濃度后，使用紫外-可見分光光度計測定其在200～900 nm波長區(qū)域內(nèi)的紫外-可見光吸收情況，并記錄該區(qū)域內(nèi)的掃描光譜圖。根據(jù)全波長掃描光譜圖選擇含量測定的最適波長。

2.2.2 標準曲線繪制

準確稱量毛蕊異黃酮標準品10 mg置于容量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解并定容至100 mL，配制得到濃度為100 μg/mL的儲備液。精密移取適量儲備液，并使用無水乙醇稀釋得到1、5、8、10、15 μg/mL梯度濃度的標準溶液。通過紫外分光光度法，在最適吸收波長條件下，測定上述系列標準溶液的吸光度。以質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，并通過最小二乘法擬合出線性回歸方程。

2.2.3 精密度測定

取2.2.2部分低、中、高濃度的線性樣品連續(xù)測定5次，測定其在最適波長下的吸光度，記錄吸光度數(shù)值并計算相對標準偏差（）。

2.2.4 復合率的測定方法

利用毛蕊異黃酮不溶于正己烷，成功形成毛蕊異黃酮-磷脂復合物后則易溶于正己烷的特性[10-11]，在樣品制備結束后，稱取適量樣品置于燒杯中，加入適量正己烷溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾之后，收集濾液并減壓蒸發(fā)去除多余正己烷，使用無水乙醇溶解并稀釋適宜倍數(shù)，于最適吸收波長條件下，測定其中毛蕊異黃酮的吸光度，使用標準曲線的回歸方程，計算復合物中毛蕊異黃酮的含量。根據(jù)初始投料量（0）與復合物中毛蕊異黃酮的質量（t）計算復合率（），計算公式為：（%）＝t/0×100%。

2.3 單因素影響試驗

2.3.1 反應溶劑篩選

根據(jù)文獻調(diào)研[9]和前期試驗結果，在本項研究中，首先對復合反應的溶劑系統(tǒng)進行了篩選。設定了毛蕊異黃酮與磷脂的投料比為1∶10（質量比例，下同），復合時間為60 min。以毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率為評價指標，對甲醇、無水乙醇、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、四氫呋喃進行考察，以篩選出最佳的復合溶劑。

2.3.2 溶劑系統(tǒng)pH值篩選

選定復合溶劑之后，對該復合溶劑系統(tǒng)的pH值進行篩選，在篩選的過程中保持毛蕊異黃酮與磷脂的投料比為1∶10，復合時間為60 min。設定溶劑系統(tǒng)的pH值為1.0、3.0、5.0、6.0、8.0、10.0，以復合率為評價指標，篩選出反應溶劑系統(tǒng)的最佳pH值。

2.3.3 投料比例篩選

使用選定的復合溶劑，并且在選定的pH條件下，保持復合反應為60 min。以毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率為評價指標，設定毛蕊異黃酮與磷脂的投料比為1∶1、1∶3、1∶5、1∶8、1∶10，對毛蕊異黃酮與磷脂的投料比例進行篩選。

2.3.4 超聲反應時間篩選

使用選定的復合溶劑，并且在選定的pH條件及投料比例下，以毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率為評價指標，設定復合時間分別為5、15、30、60、90 min，對復合時間進行篩選。

2.4 正交設計試驗

根據(jù)單因素試驗結果，選擇最佳反應溶劑系統(tǒng)為無水乙醇，復合反應受到溶劑系統(tǒng)pH值（A）、毛蕊異黃酮與磷脂的投料比例（B）、復合時間（C）的影響。因此，進行上述3因素3水平的正交試驗，以復合率為指標篩選出最佳的處方工藝。正交設計因素水平表如表1所示。

表1 正交設計因素水平表

水平溶劑系統(tǒng)pH值（A）投料比例（B）復合時間（C） WCaly：W磷脂min 15.01∶315 26.01∶530 38.01∶860

2.5 優(yōu)化處方下復合物的放置穩(wěn)定性

在優(yōu)選的處方工藝下，制備3批毛蕊異黃酮-磷脂復合物，分別測定其復合率，并且于4 ℃條件下密封放置0、1、2、3個月，對該優(yōu)選處方下放置穩(wěn)定性進行評價。

3 結果與分析

3.1 毛蕊異黃酮的含量測定方法

3.1.1 全波長掃描

按照既定試驗方法，使用紫外-可見分光光度計測定毛蕊異黃酮溶液在200～900 nm波長區(qū)域內(nèi)的紫外-可見光吸收情況，并記錄該區(qū)域內(nèi)的掃描光譜圖，如圖1所示。根據(jù)全波長掃描光譜圖選擇含量測定的最適波長為290 nm。

圖1 毛蕊異黃酮溶液的全波長掃描光譜圖

3.1.2 標準曲線繪制

按照既定的試驗方法，配制不同濃度毛蕊異黃酮標準品系列溶液，使用紫外分光光度法測定其在290 nm波長處的吸光度。結果表明：以吸光度Abs（縱坐標，）對濃度c（μg/mL，橫坐標，）進行線性回歸，擬合得出的回歸方程為＝0.052 2＋0.008 9（2＝0.999 3），毛蕊異黃酮標準品系列溶液在0～15 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，如圖2所示。

圖2 毛蕊異黃酮標準品系列溶液標準曲線

3.1.3 精密度測定

按照既定的試驗方法，低、中、高濃度毛蕊異黃酮標準品溶液的精密度測定結果如表2所示。

表2 精密度試驗結果

濃度A1A2A3A4A5`A±SDRSD μg·mL-1% 1.00.087 30.087 90.087 80.087 60.087 60.087 6±0.000 20.26 8.00.446 10.446 30.445 80.445 90.445 80.446 0±0.000 20.05 15.00.775 10.775 20.775 10.775 50.775 30.775 2±0.000 20.02

注：為待測溶液在290 nm處的吸光度數(shù)值；為標準偏差；（%）為相對標準偏差

測定結果表明：對低、中、高濃度對照品溶液分別連續(xù)重復5次測定的值均小于2%，表明本法的精密度良好。

3.2 單因素影響試驗

3.2.1 反應溶劑篩選

根據(jù)既定試驗方法，以毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率為評價指標，對甲醇、無水乙醇、二氯甲烷、甲醇-二氯甲烷、四氫呋喃進行考察，以篩選出最佳的反應溶劑，篩選結果如圖3所示。分析結果表明：使用無水乙醇以及甲醇-二氯甲烷的溶劑系統(tǒng)制備毛蕊異黃酮-磷脂復合物時，復合率均高于其他幾種溶劑，但考慮到試劑的毒性，選擇了無水乙醇作為復合反應溶劑。

圖3 復合溶劑篩選結果

3.2.2 溶劑系統(tǒng)pH值篩選

根據(jù)既定試驗方法，在篩選的過程中保持毛蕊異黃酮與磷脂的投料比為1∶10，超聲復合時間為60 min，并以無水乙醇作為復合溶劑。以復合率為評價指標，篩選出復合溶劑系統(tǒng)的最佳pH值，篩選結果如圖4所示。

分析結果表明：當復合溶劑系統(tǒng)的pH值從1.0升高至6.0時，復合率逐漸升高；pH為6.0時復合率達到最高，隨后便開始降低。

圖4 溶劑系統(tǒng)pH值的單因素篩選結果

3.2.3 投料比例篩選

根據(jù)既定試驗方法，保持溶劑系統(tǒng)的pH值為6.0、復合時間為60 min條件下，以毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率為評價指標，對毛蕊異黃酮與磷脂的投料比例進行篩選，結果如圖5所示。

分析結果表明：隨著磷脂用量的增加，復合率呈現(xiàn)增長的趨勢，并且在1∶3之后逐漸趨近于復合平衡，復合率基本達到90%左右。

圖5 毛蕊異黃酮與磷脂的投料比例（質量比例）單因素篩選結果

3.2.4 復合反應時間篩選

在選定的反應溶劑、選定的pH條件及投料比例下，以毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率為評價指標，對復合時間進行篩選，篩選結果如圖6所示。分析結果表明：當復合時間為15 min時，復合率即達到90%以上，之后，隨著超聲時間增加，未見復合率進一步顯著增加。

圖6 復合時間的單因素篩選結果

3.3 正交設計試驗

通過3因素3水平（L9，34）正交設計，復合率作為評價指標，對溶劑系統(tǒng)pH值（A）、毛蕊異黃酮與磷脂的投料比例（B）、復合時間（C）進行正交篩選，得出制備毛蕊異黃酮-磷脂復合物的最佳處方，正交分析結果如表3所示。

表3 處方篩選的正交試驗結果

樣品編號溶劑系統(tǒng)pH值（A）投料比例（B）復合時間（C）復合率 WCaly：W磷脂min% 111170.7 212278.1 313376.3 421270.7 522395.2 623193.4 731342.3 832140.7 933237.6 k 175.03361.23368.267 k 286.43371.33362.133 k 340.20069.10071.267 R46.23310.100 9.134

分析結果表明：在影響該磷脂復合物復合率的三大因素中，溶劑系統(tǒng)pH值對復合率的影響較大，其次是復合時間與投料比例。通過正交極差分析得出最優(yōu)的處方為A2B2C3，即溶劑系統(tǒng)pH值為6.0、毛蕊異黃酮與磷脂的質量比例為1∶5、復合時間為60 min。

3.4 優(yōu)化處方下磷脂復合物的穩(wěn)定性評價

按照最優(yōu)處方條件制備了3批毛蕊異黃酮-磷脂復合物，并且對其放置穩(wěn)定性進行了初步的穩(wěn)定性評價表征，結果如表4所示?？疾旖Y果表明：優(yōu)選處方下制備的3批毛蕊異黃酮-磷脂復合物的復合率為（93.7±1.42）%，外觀呈黃色干燥顆粒狀。將上述3批復合物置于4 ℃條件下進行放置穩(wěn)定性評價，結果表明：優(yōu)選處方下毛蕊異黃酮-磷脂復合物放置3個月內(nèi)穩(wěn)定性良好，復合率以及毛蕊異黃酮含量均未發(fā)生顯著變化。

表4 毛蕊異黃酮-磷脂復合物的放置穩(wěn)定性評價（4 ℃）

評價項目0個月1個月2個月 復合率/%93.7±1.4292.8±2.5990.3±3.46 含量/%16.83±0.1716.74±0.5216.53±0.12 外觀干燥黃色顆粒狀物干燥黃色顆粒狀物干燥黃色顆粒狀物

4 討論

根據(jù)形成機制，磷脂復合物是以磷脂作為分散載體（或者分散介質），通過適宜的方法制備的一類固體分散體，其中，活性藥物以無定形的狀態(tài)均勻分散在分散載體中，能顯著改善難溶性藥物的溶解性、溶解速度及生物利用度[10]。根據(jù)藥物的性質，可通過多種方法來制備磷脂復合物，包括冷凍干燥法、熔融法等[11-12]。本研究通過篩選適宜的復合溶劑系統(tǒng)及工藝條件，首次制備成功毛蕊異黃酮-磷脂復合物，有望為其進一步應用提供理論基礎，具有很大的發(fā)展空間以及實際應用價值。但是，在本研究中尚未對復合機制進行深入研究和闡述，將在后續(xù)研究中進行。

本研究中，發(fā)現(xiàn)在毛蕊異黃酮-磷脂復合物復合率的限制因素中，當毛蕊異黃酮與磷脂的質量比例為1∶3時，復合率即可達到90%左右，這可能與毛蕊異黃酮是小分子量的黃酮化合物有關。研究表明，形成磷脂復合物時，藥物分子中的羰基會與磷脂分子中的羥基形成氫鍵[13-15]，或者通過范德華力形成弱鍵連接。毛蕊異黃酮中僅有1個羰基，因此，形成磷脂復合物時所需的磷脂分子數(shù)量較少，宏觀表現(xiàn)為復合時所需的磷脂質量較少。

在試驗過程中，發(fā)現(xiàn)復合溶劑系統(tǒng)的pH值對于復合率的影響最大。事實上，在制備過程中發(fā)現(xiàn)，如果溶劑的pH值偏離5.0～8.0時，大量的毛蕊異黃酮沉淀在底部，無法與磷脂溶液進行復合，導致毛蕊異黃酮-磷脂復合物基本不能復合成型。這可能是由于改變或調(diào)節(jié)pH值時加入的某些離子，影響了毛蕊異黃酮在有機溶劑中的溶解性，導致其無法在均一的溶液中以分子狀態(tài)與磷脂分子發(fā)生復合作用。因此，在后續(xù)的研究中，有必要針對難溶性藥物的溶解狀態(tài)與復合率的關系進行相關研究。

[1] 于玲，王知斌，王秋紅，等. 黃芪中黃酮類化合物藥理作用研究進展[J]. 中醫(yī)藥信息，2018，35（2）：104-108.

[2] 梁小銀，嚴萍，詹若挺，等. 新胃乃安片中4種異黃酮成分的同時鑒別及抗氧化活性的初步篩選[J]. 湖南中醫(yī)雜志，2018，34（7）：186-187，206.

[3] 張亞洲，徐風，梁靜. 蒙古黃芪中異黃酮類化學成分研究[J]. 中國中藥雜志，2012，37（21）：3243-3248.

[4] 張冬青，王海寶，王淑芳，等. 毛蕊異黃酮生物活性的研究進展[J]. 中國中藥雜志，2015，40（22）：4339-4345.

[5] 鄺潔容，陳伯叢，梁曉燕. 毛蕊異黃酮葡萄糖苷自微乳給藥系統(tǒng)的制備及質量控制[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析，2017，17（7）：885-888.

[6] 李楠，馮玲玲，蔣學華，等. 黃芩苷磷脂復合物大鼠在體胃腸道吸收研究[J]. 中國藥學雜志，2016，51（12）：994-998.

[7] 王夢姝，呂曉玲，趙煥焦，等. 黑米花色苷磷脂復合物的制備及生物利用度[J]. 食品科技，2017（5）：242-245.

[8] 鄭林. 磷脂復合物對中藥制劑口服吸收的影響[J]. 中國抗生素雜志，2015，40（6）：468-473.

[9] 張冬青，王海寶，王淑芳，等. 毛蕊異黃酮生物活性的研究進展[J]. 中國中藥雜志，2015，40（22）：4339-4345.

[10] Shi C，Tong Q，F(xiàn)ang J，et al. Preparation，characterization and in vivo studies of amorphous solid dispersion of berberine with hydrogenated phosphatidylcholine[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences，2015，74：11-17.

[11] Cui F，Shi K，Zhang L Q，et al. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery：Preparation，in vitro characterization and in vivo evaluation[J]. Journal of Controlled Release，2006， 114（2）：242-250.

[12] 余鳳瑋，聶績，袁野. 穿心蓮內(nèi)酯磷脂復合物的制備及表征[J]. 中國藥房，2016，27（10）：1409-1411.

[13] 張紅敏，李琬晴，高靜，等. 羥基喜樹堿-磷脂復合物的制備、表征及細胞毒性評價[J]. 國際藥學研究雜志，2017，44（7）：714-721.

[14] 張文華，張芳，王漢卿，等. 甘草黃酮磷脂復合物制備工藝研究[J]. 藥學研究，2017，36（8）：457-459，476.

[15] 孫靜，史亞軍，張小飛，等. 丹參片提取物磷脂復合物的制備及初步吸收評價[J]. 中藥材，2017，40（1）：164-166.

Formulation optimization of calycosin phospholipid complex

SHI Zhuo-qia, LIU Li-yaoa,b,Corresponding Author, XIONG Qiana, WANG Qing-kuib

（Tianjin Agricultural University, a. Department of Biopharmaceuticals, College of Basic Science; b. Tianjin Key Lab of Aquatic Ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China）

Calycosin is an active substance extracted and separated from. It could combine with estrogen receptor and generate estrogen-like action, antitumor and immunoregulation effect. However, because of its poor lipophilicity, it is difficult to be utilized in medical preparation. And itsbioavailability is usually extremely low. This study was designed to increase the lipophilicity of calycosin using phospholipid complexation technology. In this study, associative efficiency（）was set as screening parameter and optimal formulation of calycosin phospholipid complex was obtained using solvent evaporation method based on single factor screening and orthogonal design. Under the selected formulation, mass ratio of calycosin to phospholipid was 1∶5 and composite time was 60 minutes in ethanol of pH 6.0. For the selected formulation,of calycosin phospholipid complex could reach 90% and storage stability remained in 3 months under 4 ℃. Compared with calycosin material medicine, the lipophilicity of phospholipid complex was increased by 600 times, which provides the basis for practical application.

calycosin; phospholipid complex; orthogonal screening; formulation optimization

1008-5394（2019）04-0077-06

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.016

基礎。

P641.131；S152.72

A

2019-1-13

天津市教委科研計劃項目（2017KJ181）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊項目（ITTFRS2017004）；國家自然科學基金面上項目（31170442）

史卓琪（1997-），女，本科在讀，主要從事藥物制劑方面的研究。E-mail：894309228@qq.com。

劉黎瑤（1988-），女，講師，博士，主要從事藥物制劑方面的研究。E-mail：llymeilin@163.com。

責任編輯：張愛婷