顧松松,胡秋龍,劉仲華,龔志華,李 適,譚 琳*
(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128;2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410128)
土壤微生物在土壤物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化、植物抗逆性、生長(zhǎng)發(fā)育及生產(chǎn)力等方面發(fā)揮著極其重要的作用[1-2]。如根瘤菌(Rhizombiunm)和弗蘭克菌(Frankia)等固氮細(xì)菌可以提高作物產(chǎn)量,增加植物對(duì)氮元素的吸收[3]。假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)和農(nóng)桿菌(Agrobacterium)可通過(guò)產(chǎn)生植物激素或分子信號(hào)、競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)位點(diǎn)、鐵載體等促生長(zhǎng)機(jī)制促進(jìn)植物生長(zhǎng),增強(qiáng)對(duì)病原菌的抗性[4-5]。根際是直接受植物根系和分泌物影響的土壤區(qū)域,是土壤微生物與植物相互作用的重要場(chǎng)所。近年來(lái),利用生物工程技術(shù)在分子水平上對(duì)植物土壤微生物多樣性的研究很多,但大多數(shù)主要集中在作物和森林[6-8],對(duì)茶樹(shù)根際土壤微生物多樣性的研究報(bào)道較少。本文選取有機(jī)、無(wú)公害和普通等3種不同管理模式的茶園,研究茶樹(shù)根際土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu),旨在為發(fā)揮微生物根際效益、調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境、改善土壤質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。
選取有機(jī)、無(wú)公害和普通等3種不同管理模式的茶園土壤,采樣地點(diǎn)分別為:有機(jī)茶園(湖南長(zhǎng)沙縣茶園,OTP)、無(wú)公害茶園(湖南長(zhǎng)沙望城茶園,NPTP)和普通茶園(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園,CTP),每個(gè)實(shí)驗(yàn)茶園都大于666.7 m2。施肥和施藥:有機(jī)茶園2、9月份施腐熟的家畜糞尿、菜籽餅肥以及商品有機(jī)肥,全年施肥量為 250~350 kg/666.7 m2,施用生物農(nóng)藥;無(wú)公害茶園2、5、7、9月份施尿素和復(fù)合肥,全年施肥量為 80~100 kg/666.7 m2,施用化學(xué)農(nóng)藥為主;普通茶園2、9月份施尿素,全年施肥量為 80~100 kg/666.7 m2,施用化學(xué)農(nóng)藥。
依據(jù)《土壤分析技術(shù)規(guī)范》(2006)按“S”點(diǎn)位采集土樣。2017年8月,每個(gè)茶園取30個(gè)茶樹(shù)根際土壤樣品,每5個(gè)樣品充分混合后再仔細(xì)混勻,剔除石塊和雜物后堆成厚度均一的四方形,對(duì)角線法劃分成四等分,去掉對(duì)角線2份,依此方法重復(fù)操作,直到樣品重量達(dá)到所需,形成一個(gè)復(fù)合樣品。每個(gè)茶園采集6個(gè)土壤復(fù)合樣品,共計(jì)18個(gè)土壤復(fù)合樣品,一部分用于測(cè)定物理化學(xué)性狀,一部分用于分子實(shí)驗(yàn)。用于分子試驗(yàn)的土樣,密封儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱中備用。
土樣送中國(guó)科學(xué)院南京地理研究所土壤分析實(shí)驗(yàn)室,檢測(cè)pH、總有機(jī)碳(TOC)、硝酸鹽氮(NO3-N)、氨氮(NH4-N)、總氮(TN)、有效磷(AP)和總磷(TP)。
使用 Fast DNA Spin 試劑盒(MP Biomedicals LLC,USA)提取各樣本總DNA。使用NanoDrop分 光 光 度 計(jì)(Nano-100,Aosheng Instrument Co Ltd.)測(cè)量 DNA 質(zhì)量和濃度。使用 515F(5'GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和 806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物并結(jié)合自行設(shè)計(jì)用以區(qū)分樣品的條形碼,將提取的DNA用作模板用于擴(kuò)增16SrRNA基因的V4區(qū)域。PCR擴(kuò)增在50 uL反應(yīng)體系中進(jìn)行,并使用凝膠提取試劑盒(D2500-02,OMEGA BioTek)純化 DNA。按照 VAHTS TM將所有樣品組合成單個(gè)樣品的文庫(kù)制備,使用MiSeq試劑盒制備用于測(cè)序的樣品文庫(kù),送中南大學(xué)測(cè)序(Miseq測(cè)序儀)。
通過(guò)FLASH程序[9]將具有至少30 bp重疊長(zhǎng)度的成對(duì)末端序列組合成全長(zhǎng)序列,組合后平均片段長(zhǎng)度為253 bp。通過(guò)Btrim程序[10],將質(zhì)量得分閾值>20或者5的設(shè)為窗口大小,用于篩選出不合格的序列。丟棄具有模糊堿基且僅保留245~260 bp范圍內(nèi)的序列作為靶向序列。UPARSE[11]用于去除嵌合體并將相似性為97%的序列分類為同一OUT(Optical Transform Unit)。將所有樣本作為列并且所有OTU作為行的大矩陣生成為OTU表,從該表獲得Resample OTU表以標(biāo)準(zhǔn)化總序列。所有序列預(yù)處理都是通過(guò)與這些生物信息學(xué)工具集成的內(nèi)部平臺(tái)(http://mem.rcees.ac.cn:8080)進(jìn)行。
通過(guò)對(duì)Resample OUT表中觀察到的物種數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)得到Richness指數(shù)。使用Mothur程序[12]計(jì)算與稀釋曲線相關(guān)的Chao1值[13]。使用程序包(v.2.3-5)在R(v.3.2.5)中根據(jù)物種豐度計(jì)算Shannon和Inverse Simpson指數(shù)?;贔aith方法測(cè)量系統(tǒng)發(fā)育多樣性(PD),其是每個(gè)樣品中OTU的總系統(tǒng)發(fā)育分支長(zhǎng)度的總和。使用PyNAST將所選代表性O(shè)TU序列與GreenGene數(shù)據(jù)集對(duì)齊,并使用FastTree程序生成發(fā)育樹(shù)文件。使用R中的Picante包(v.3.2.5)計(jì)算PD。UniFrac矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)[14]用于微生物群落結(jié)構(gòu)變化。使用多變量方差分析(PERMANOVA)通過(guò)R(v.3.2.5)中的程序包(v.2.3-5)使用Bray-Curtis和Jaccard距離方法測(cè)試三組之間的差異。采用Pearson,Kendall和Spearman三種相關(guān)方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。通過(guò)雙尾t-test檢驗(yàn)確定兩組之間的顯著性,并且使用單因素方差分析(ANOVA)獲得多組的顯著性。
通過(guò)高通量測(cè)序分析,從18個(gè)樣品中獲得了共419,685個(gè)有效序列,并且從序列中鑒定出17,403個(gè)OTU。3種茶園土壤OTU稀疏曲線趨于平緩,表明所測(cè)序列庫(kù)容都可以較好地反映細(xì)菌群落的種類與數(shù)量,基本涵蓋了3種茶園土壤中所有細(xì)菌種群,足以進(jìn)行下游數(shù)據(jù)分析(圖1)。通過(guò)細(xì)菌多樣性指數(shù)Chao1來(lái)比較不同管理模式的茶園土壤中細(xì)菌α多樣性。所有樣本的Chao1多樣性指數(shù)從3,042到6,200不等(圖2),表明3種茶園土壤均表現(xiàn)出高水平的細(xì)菌多樣性,有機(jī)茶園土壤具有最高水平的細(xì)菌多樣性;有機(jī)茶園與普通茶園、無(wú)公害茶園土壤的細(xì)菌α多樣性存在顯著差異(P<0.05),普通茶園與無(wú)公害茶園土壤的細(xì)菌α多樣性無(wú)顯著差異?;?8個(gè)樣品中相對(duì)豐度較高(>1%)的19個(gè)細(xì)菌菌群,在屬水平上進(jìn)行了分級(jí)聚類熱圖分析(圖3)。結(jié)果表明,無(wú)公害茶園和普通茶園的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成較為相似,與有機(jī)茶園存在顯著性差異。進(jìn)一步分析了不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌群落的β多樣性,細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析(PCoA)圖顯示,在3種管理模式下,茶園土壤組之間存在明顯的分離,有機(jī)茶園的細(xì)菌群落在第二軸上與另外兩個(gè)茶園細(xì)菌群落能明顯區(qū)分開(kāi),無(wú)公害茶園細(xì)菌群落在第一軸上與其他茶園細(xì)菌群落分離(圖4)。基于MRPP、ADONIS和PERMANOVA算法的差異檢驗(yàn)結(jié)果也表明3種茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異(表1)。
表 1 不同茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析Table 1 Dissimilarity test of bacterial community structure in different tea plantation soils based on Bray-Curtis distance
圖1 不同茶園土壤細(xì)菌稀釋曲線(有機(jī)茶園土壤,OTP;無(wú)公害茶園土壤,NPTP;普通茶園土壤,CTP。下同)Fig. 1 Rarefaction curves of soil bacteria from different tea plantations
圖 2 不同茶園土壤細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)Fig. 2 Chao1 index of bacterial community in different tea plantation soils
圖 3 不同茶園土壤主要細(xì)菌菌屬的聚類熱圖分析Fig. 3 Clustering heat map analysis of major generas in different tea plantation soils
圖 4 不同茶園土壤細(xì)菌群落的主坐標(biāo)軸(PCoA)分析Fig. 4 PCoA analysis of bacterial communities in different tea plantation soils
3種茶園土壤的所有OTU被鑒定為36個(gè)門652個(gè)屬。3種茶園土壤細(xì)菌群落中的主要菌門(>1%)共有13個(gè),分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloro fl exi)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、齊古菌門(Thaumarchaeota)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、candidate division WPS-2、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍(lán)藻細(xì)菌門(Cyanobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和未分類菌門(Unclassi fied)(圖5a)。3種茶園土壤細(xì)菌群落中的主要菌屬(>1%)共有19個(gè),分別為未分類菌屬(Unclassi fied)、纖細(xì)桿菌屬(Ktedonobacter)、Gp2、Gp1、Gp3、亞硝基球藻菌屬(Nitrososphaera),第3子類:南方古陸屬(Subdivision3 generaincertae sedis)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、WPS-2南方苔蘚屬(WPS-2 genera incertae sedis)、短根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、斯巴達(dá)菌(Spartobacteria)、Actinoallomurus、Gp6、共生桿菌(Conexibacter)、蓋伊拉菌屬(Gaiella)、芽單胞菌(Gemmatimonas)、鏈霉菌(Streptophyta)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)和硝化螺菌屬(Nitrospira)(圖5b)。
3種茶園土壤的優(yōu)勢(shì)門類群相對(duì)豐度見(jiàn)表2。3種茶園樣本在5個(gè)菌門(變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、candidate division WPS-2、 浮 霉 菌 門(Planctomycetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)中所占比例差異顯著(P<0.05),其中有機(jī)茶園樣本和其他茶園樣本間差異尤其顯著(P<0.05)。在相對(duì)豐度方面,有機(jī)茶園樣本具有最高的變形菌門(Proteobacteria)(24.97%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(6.84%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)(1.16%),而普通茶園樣本的浮霉菌門(Planctomycetes)豐度最高(2.16%)。將3種管理模式的茶園土壤樣品的OTU分布進(jìn)行維恩圖(Venn diagram)分析(圖6)可知,3種茶園樣本共有1,454個(gè)OUTs,在各自總OTU數(shù)量中占不同比例,分別為占有機(jī)茶園樣本OTU數(shù)量(6, 056個(gè))的24.01%、占無(wú)公害茶園樣本OTU數(shù)(4,686個(gè))的31.02%和占普通茶園樣本OTU數(shù)(4, 310個(gè))的33.74%。3種茶園土壤樣本各自特有的OTU在各自總OTU數(shù)量中占不同比例,分別為有機(jī)茶園的56.29%、無(wú)公害茶園的37.81%和普通茶園的29.12%。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致,即有機(jī)茶園管理模式下的土壤細(xì)菌群落組成與無(wú)公害茶園和普通茶園存在顯著差異。
圖 5 不同茶園土壤細(xì)菌群落主要菌門和屬的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of domain phyla and genera in bacterial communities of different tea plantation soils
圖 6 不同茶園土壤樣品OTU分布的Venn分析圖。圖中數(shù)據(jù)代表不同OTU數(shù)量。Fig. 6 Venn diagram of OTU distribution of different tea plantation soil samples. The data in the figure represents the number of OTU
土壤樣品理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。其中TP、AP和NO3-N含量與pH值在三種茶園中存在顯著差異,有機(jī)茶園土壤TP含量最高,無(wú)公害茶園次之,普通茶園含量最低;硝態(tài)氮含量有機(jī)茶園與普通茶園差異不明顯,但都高于無(wú)公害茶園;有機(jī)茶園的AP含量與pH值為最高,無(wú)公害茶園與普通茶園差異不明顯。通過(guò)對(duì)茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子間的mantel test分析,結(jié)果表明TP、AP和pH是土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因子(表4)。
表2 不同茶園土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)門的相對(duì)豐度Table 2 Relative abundance of dominant phylum in tea plantation soil bacterial community under different management mode
表3 不同茶園土壤理化性質(zhì)Table 3 Soil properties of different tea plantations
表 4 不同茶園土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性的mantel test分析Table 4 Mantel test analysis on the correlation between environmental factors of different tea plantations and soil microbial community structure
本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)3種不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了初步研究,α多樣性指數(shù)結(jié)果顯示,3種不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌多樣性有顯著性差異,且有機(jī)茶園多樣性顯著高于另外兩種管理模式下的茶園;β多樣性分析結(jié)果表明,有機(jī)、無(wú)公害以及普通茶園的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。土壤微生物種群的豐度和多樣性對(duì)土壤質(zhì)量、功能和土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性起著重要的作用。多樣性指數(shù)是評(píng)價(jià)細(xì)菌群落多樣性的重要指標(biāo),多樣性指數(shù)越高表明細(xì)菌群落的豐富度和多樣性越高。袁紅朝[15]、徐永剛[16]研究表明施有機(jī)肥和秸稈還田均顯著增加土壤細(xì)菌多樣性。呂寧等[17]研究表明土壤細(xì)菌數(shù)量與物種豐度隨著生物農(nóng)藥施用量增加而顯著增加。張仕穎[19]、張?chǎng)20]研究表明,施用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)降低水稻田微生物群落的碳源利用能力,從而降低微生物多樣性。本研究結(jié)果顯示有機(jī)茶園中細(xì)菌群落的Chao1多樣性指數(shù)明顯高于另外兩個(gè)茶園,可能一方面是由于有機(jī)肥的施用,土壤有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀等可利用性增加,為更多的微生物提供了生長(zhǎng)和繁殖的條件,從而土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)提高;另一方面,有機(jī)茶園中施用生物農(nóng)藥而非化學(xué)農(nóng)藥也是微生物多樣性提高的一個(gè)重要原因。
本研究結(jié)果表明變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠彎菌門(Chloro fl exi)在3種不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌中都屬于優(yōu)勢(shì)菌群。從屬水平和OUT分布結(jié)果來(lái)看,有機(jī)茶園和無(wú)公害、普通茶園土壤有顯著差異性。無(wú)公害和普通茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中具有一定的同源性,但在低豐度的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面存在一定特異性,且細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門豐度也存在顯著差異。不同茶園土壤樣品的優(yōu)勢(shì)門為變形菌門(Proteobacteria)(25.84%),其次為酸桿菌門(Acidobacteria)(21.53%)。這兩個(gè)群體在土壤樣品中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)[21]。Janssen等[22]的研究結(jié)果表明各種土壤中細(xì)菌門中數(shù)量最多的是變形菌門(Proteobacteria)(39%)和酸桿菌門(Acidobacteria)(19%),雖然相對(duì)豐度比例不同,但與我們的結(jié)果一致。在處理后的OTP土壤樣品中,變形菌門(Proteobacteria)(24.97%)的相對(duì)豐度最高。Li等[23]指出β變形菌(β-Proteobacteria)是具有共生性并與大量可利用的營(yíng)養(yǎng)物有關(guān)。這可能在一定程度上能解釋有機(jī)茶園土壤具有較高水平的細(xì)菌多樣性。此外,有機(jī)茶園土壤中硝化螺旋菌(Nitrospirae)的豐度明顯高于無(wú)公害和普通茶園。硝化螺旋菌(Nitrospirae)與氮循環(huán)密切相關(guān),主要參與亞硝酸鹽向硝酸鹽的轉(zhuǎn)化,在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中具有不可替代的生態(tài)作用[24]。Martiny等[25]的研究表明,在生物膜和大體積水樣中,亞硝化體和亞硝化螺旋體都在硝化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,能夠有效促進(jìn)土壤中的氮循環(huán);同時(shí)氮含量的增加可以為茶園土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)提供足夠的養(yǎng)分,從而提高茶園土壤細(xì)菌的多樣性。
有機(jī)肥能改變土壤理化性質(zhì)[26],陳貴[30]、吳志丹[31]研究表明施用有機(jī)肥能顯著增加土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、總磷和速效鉀含量。楊君等[32]發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥施用率高的茶園,其表層土壤中的磷含量高于其他施肥方式的茶園,有效磷的增加可以提高微生物多樣性[37],提高茶園生產(chǎn)力[33]。pH值是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的最強(qiáng)因素[38-39],提高土壤pH對(duì)土壤微生物生物量和細(xì)菌群落多樣性具有積極意義[40]。有機(jī)肥料施用能改善土壤pH值[34-36],為土壤提供了有機(jī)碳源增加微生物活性[29],對(duì)土壤細(xì)菌多樣性產(chǎn)生積極影響[27-28]。本研究結(jié)果表明,3種管理模式中有機(jī)茶園TP、AP含量和pH值顯著高于其他兩種茶園,且土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系分析也顯示,TP、AP和pH是影響茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要土壤理化因子,與上述研究結(jié)果一致。