顧松松，胡秋龍，劉仲華，龔志華，李 適，譚 琳*

（1. 湖南農業(yè)大學 植物保護學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農業(yè)大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410128）

土壤微生物在土壤物質和能量的轉化、植物抗逆性、生長發(fā)育及生產力等方面發(fā)揮著極其重要的作用[1-2]。如根瘤菌（Rhizombiunm）和弗蘭克菌（Frankia）等固氮細菌可以提高作物產量，增加植物對氮元素的吸收[3]。假單胞菌（Pseudomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）和農桿菌（Agrobacterium）可通過產生植物激素或分子信號、競爭生長位點、鐵載體等促生長機制促進植物生長，增強對病原菌的抗性[4-5]。根際是直接受植物根系和分泌物影響的土壤區(qū)域，是土壤微生物與植物相互作用的重要場所。近年來，利用生物工程技術在分子水平上對植物土壤微生物多樣性的研究很多，但大多數主要集中在作物和森林[6-8]，對茶樹根際土壤微生物多樣性的研究報道較少。本文選取有機、無公害和普通等3種不同管理模式的茶園，研究茶樹根際土壤細菌多樣性和群落結構，旨在為發(fā)揮微生物根際效益、調節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境、改善土壤質量提供數據支持和理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取有機、無公害和普通等3種不同管理模式的茶園土壤，采樣地點分別為：有機茶園（湖南長沙縣茶園，OTP）、無公害茶園（湖南長沙望城茶園，NPTP）和普通茶園（湖南農業(yè)大學茶園，CTP），每個實驗茶園都大于666.7 m2。施肥和施藥：有機茶園2、9月份施腐熟的家畜糞尿、菜籽餅肥以及商品有機肥，全年施肥量為 250～350 kg/666.7 m2，施用生物農藥；無公害茶園2、5、7、9月份施尿素和復合肥，全年施肥量為 80～100 kg/666.7 m2，施用化學農藥為主；普通茶園2、9月份施尿素，全年施肥量為 80～100 kg/666.7 m2，施用化學農藥。

依據《土壤分析技術規(guī)范》（2006）按“S”點位采集土樣。2017年8月，每個茶園取30個茶樹根際土壤樣品，每5個樣品充分混合后再仔細混勻，剔除石塊和雜物后堆成厚度均一的四方形，對角線法劃分成四等分，去掉對角線2份，依此方法重復操作，直到樣品重量達到所需，形成一個復合樣品。每個茶園采集6個土壤復合樣品，共計18個土壤復合樣品，一部分用于測定物理化學性狀，一部分用于分子實驗。用于分子試驗的土樣，密封儲存在-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 土壤理化性狀測定

土樣送中國科學院南京地理研究所土壤分析實驗室，檢測pH、總有機碳（TOC）、硝酸鹽氮（NO3-N）、氨氮（NH4-N）、總氮（TN）、有效磷（AP）和總磷（TP）。

1.3 DNA提取和擴增子測序

使用 Fast DNA Spin 試劑盒（MP Biomedicals LLC，USA）提取各樣本總DNA。使用NanoDrop分 光 光 度 計（Nano-100，Aosheng Instrument Co Ltd.）測量 DNA 質量和濃度。使用 515F（5'GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物并結合自行設計用以區(qū)分樣品的條形碼，將提取的DNA用作模板用于擴增16SrRNA基因的V4區(qū)域。PCR擴增在50 uL反應體系中進行，并使用凝膠提取試劑盒（D2500-02，OMEGA BioTek）純化 DNA。按照 VAHTS TM將所有樣品組合成單個樣品的文庫制備，使用MiSeq試劑盒制備用于測序的樣品文庫，送中南大學測序（Miseq測序儀）。

1.4 序列預處理和生物信息學方法

通過FLASH程序[9]將具有至少30 bp重疊長度的成對末端序列組合成全長序列，組合后平均片段長度為253 bp。通過Btrim程序[10]，將質量得分閾值＞20或者5的設為窗口大小，用于篩選出不合格的序列。丟棄具有模糊堿基且僅保留245～260 bp范圍內的序列作為靶向序列。UPARSE[11]用于去除嵌合體并將相似性為97%的序列分類為同一OUT（Optical Transform Unit）。將所有樣本作為列并且所有OTU作為行的大矩陣生成為OTU表，從該表獲得Resample OTU表以標準化總序列。所有序列預處理都是通過與這些生物信息學工具集成的內部平臺（http：//mem.rcees.ac.cn：8080）進行。

1.5 生態(tài)和統(tǒng)計分析

通過對Resample OUT表中觀察到的物種數量進行計數得到Richness指數。使用Mothur程序[12]計算與稀釋曲線相關的Chao1值[13]。使用程序包（v.2.3-5）在R（v.3.2.5）中根據物種豐度計算Shannon和Inverse Simpson指數?；贔aith方法測量系統(tǒng)發(fā)育多樣性（PD），其是每個樣品中OTU的總系統(tǒng)發(fā)育分支長度的總和。使用PyNAST將所選代表性OTU序列與GreenGene數據集對齊，并使用FastTree程序生成發(fā)育樹文件。使用R中的Picante包（v.3.2.5）計算PD。UniFrac矩陣的主坐標分析（PCoA）[14]用于微生物群落結構變化。使用多變量方差分析（PERMANOVA）通過R（v.3.2.5）中的程序包（v.2.3-5）使用Bray-Curtis和Jaccard距離方法測試三組之間的差異。采用Pearson，Kendall和Spearman三種相關方法進行關聯(lián)性分析。通過雙尾t-test檢驗確定兩組之間的顯著性，并且使用單因素方差分析（ANOVA）獲得多組的顯著性。

2 結果與分析

2.1 三種類型茶園土壤的細菌多樣性和群落結構差異性

通過高通量測序分析，從18個樣品中獲得了共419,685個有效序列，并且從序列中鑒定出17,403個OTU。3種茶園土壤OTU稀疏曲線趨于平緩，表明所測序列庫容都可以較好地反映細菌群落的種類與數量，基本涵蓋了3種茶園土壤中所有細菌種群，足以進行下游數據分析（圖1）。通過細菌多樣性指數Chao1來比較不同管理模式的茶園土壤中細菌α多樣性。所有樣本的Chao1多樣性指數從3,042到6,200不等（圖2），表明3種茶園土壤均表現出高水平的細菌多樣性，有機茶園土壤具有最高水平的細菌多樣性；有機茶園與普通茶園、無公害茶園土壤的細菌α多樣性存在顯著差異（P＜0.05），普通茶園與無公害茶園土壤的細菌α多樣性無顯著差異。基于18個樣品中相對豐度較高（＞1%）的19個細菌菌群，在屬水平上進行了分級聚類熱圖分析（圖3）。結果表明，無公害茶園和普通茶園的土壤細菌群落結構和組成較為相似，與有機茶園存在顯著性差異。進一步分析了不同管理模式的茶園土壤細菌群落的β多樣性，細菌群落的主坐標分析（PCoA）圖顯示，在3種管理模式下，茶園土壤組之間存在明顯的分離，有機茶園的細菌群落在第二軸上與另外兩個茶園細菌群落能明顯區(qū)分開，無公害茶園細菌群落在第一軸上與其他茶園細菌群落分離（圖4）?；贛RPP、ADONIS和PERMANOVA算法的差異檢驗結果也表明3種茶園土壤細菌群落結構存在顯著差異（表1）。

表 1 不同茶園土壤細菌群落結構差異性分析Table 1 Dissimilarity test of bacterial community structure in different tea plantation soils based on Bray-Curtis distance

圖1 不同茶園土壤細菌稀釋曲線（有機茶園土壤，OTP；無公害茶園土壤，NPTP；普通茶園土壤，CTP。下同）Fig. 1 Rarefaction curves of soil bacteria from different tea plantations

圖 2 不同茶園土壤細菌群落的Chao1指數Fig. 2 Chao1 index of bacterial community in different tea plantation soils

圖 3 不同茶園土壤主要細菌菌屬的聚類熱圖分析Fig. 3 Clustering heat map analysis of major generas in different tea plantation soils

圖 4 不同茶園土壤細菌群落的主坐標軸(PCoA)分析Fig. 4 PCoA analysis of bacterial communities in different tea plantation soils

2.2 三種類型茶園土壤細菌群落組成差異性

3種茶園土壤的所有OTU被鑒定為36個門652個屬。3種茶園土壤細菌群落中的主要菌門（＞1%）共有13個，分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloro fl exi）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、齊古菌門（Thaumarchaeota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、candidate division WPS-2、浮霉菌門（Planctomycetes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和未分類菌門（Unclassi fied）（圖5a）。3種茶園土壤細菌群落中的主要菌屬（＞1%）共有19個，分別為未分類菌屬（Unclassi fied）、纖細桿菌屬（Ktedonobacter）、Gp2、Gp1、Gp3、亞硝基球藻菌屬（Nitrososphaera），第3子類：南方古陸屬（Subdivision3 generaincertae sedis）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、WPS-2南方苔蘚屬（WPS-2 genera incertae sedis）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、斯巴達菌（Spartobacteria）、Actinoallomurus、Gp6、共生桿菌（Conexibacter）、蓋伊拉菌屬（Gaiella）、芽單胞菌（Gemmatimonas）、鏈霉菌（Streptophyta）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和硝化螺菌屬（Nitrospira）（圖5b）。

3種茶園土壤的優(yōu)勢門類群相對豐度見表2。3種茶園樣本在5個菌門（變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、candidate division WPS-2、 浮 霉 菌 門（Planctomycetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）中所占比例差異顯著(P＜0.05)，其中有機茶園樣本和其他茶園樣本間差異尤其顯著(P＜0.05)。在相對豐度方面，有機茶園樣本具有最高的變形菌門（Proteobacteria）(24.97%)、疣微菌門（Verrucomicrobia）（6.84%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（1.16%），而普通茶園樣本的浮霉菌門（Planctomycetes）豐度最高(2.16%)。將3種管理模式的茶園土壤樣品的OTU分布進行維恩圖(Venn diagram)分析(圖6)可知，3種茶園樣本共有1,454個OUTs，在各自總OTU數量中占不同比例，分別為占有機茶園樣本OTU數量（6, 056個）的24.01%、占無公害茶園樣本OTU數（4,686個）的31.02%和占普通茶園樣本OTU數（4, 310個）的33.74%。3種茶園土壤樣本各自特有的OTU在各自總OTU數量中占不同比例，分別為有機茶園的56.29%、無公害茶園的37.81%和普通茶園的29.12%。該結果與聚類分析結果一致，即有機茶園管理模式下的土壤細菌群落組成與無公害茶園和普通茶園存在顯著差異。

圖 5 不同茶園土壤細菌群落主要菌門和屬的相對豐度Fig.5 Relative abundance of domain phyla and genera in bacterial communities of different tea plantation soils

圖 6 不同茶園土壤樣品OTU分布的Venn分析圖。圖中數據代表不同OTU數量。Fig. 6 Venn diagram of OTU distribution of different tea plantation soil samples. The data in the figure represents the number of OTU

2.3 三種類型茶園土壤細菌群落結構與土壤理化性質的相關性

土壤樣品理化性質測定結果見表3。其中TP、AP和NO3-N含量與pH值在三種茶園中存在顯著差異，有機茶園土壤TP含量最高，無公害茶園次之，普通茶園含量最低；硝態(tài)氮含量有機茶園與普通茶園差異不明顯，但都高于無公害茶園；有機茶園的AP含量與pH值為最高，無公害茶園與普通茶園差異不明顯。通過對茶園土壤細菌群落結構與土壤理化因子間的mantel test分析，結果表明TP、AP和pH是土壤細菌群落組成的主要影響因子（表4）。

表2 不同茶園土壤細菌群落優(yōu)勢門的相對豐度Table 2 Relative abundance of dominant phylum in tea plantation soil bacterial community under different management mode

表3 不同茶園土壤理化性質Table 3 Soil properties of different tea plantations

表 4 不同茶園土壤理化性質與細菌群落結構相關性的mantel test分析Table 4 Mantel test analysis on the correlation between environmental factors of different tea plantations and soil microbial community structure

3 討論

3.1 不同管理模式對茶園細菌多樣性的影響

本研究基于高通量測序技術對3種不同管理模式的茶園土壤細菌多樣性進行了初步研究，α多樣性指數結果顯示，3種不同管理模式的茶園土壤細菌多樣性有顯著性差異，且有機茶園多樣性顯著高于另外兩種管理模式下的茶園；β多樣性分析結果表明，有機、無公害以及普通茶園的土壤細菌群落結構存在顯著差異。土壤微生物種群的豐度和多樣性對土壤質量、功能和土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性起著重要的作用。多樣性指數是評價細菌群落多樣性的重要指標，多樣性指數越高表明細菌群落的豐富度和多樣性越高。袁紅朝[15]、徐永剛[16]研究表明施有機肥和秸稈還田均顯著增加土壤細菌多樣性。呂寧等[17]研究表明土壤細菌數量與物種豐度隨著生物農藥施用量增加而顯著增加。張仕穎[19]、張雯雯[20]研究表明，施用化學農藥會降低水稻田微生物群落的碳源利用能力，從而降低微生物多樣性。本研究結果顯示有機茶園中細菌群落的Chao1多樣性指數明顯高于另外兩個茶園，可能一方面是由于有機肥的施用，土壤有機質和氮、磷、鉀等可利用性增加，為更多的微生物提供了生長和繁殖的條件，從而土壤細菌多樣性指數提高；另一方面，有機茶園中施用生物農藥而非化學農藥也是微生物多樣性提高的一個重要原因。

3.2 不同管理模式對茶園細菌群落組成和結構的影響

本研究結果表明變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloro fl exi）在3種不同管理模式的茶園土壤細菌中都屬于優(yōu)勢菌群。從屬水平和OUT分布結果來看，有機茶園和無公害、普通茶園土壤有顯著差異性。無公害和普通茶園土壤細菌群落結構中具有一定的同源性，但在低豐度的細菌群落結構方面存在一定特異性，且細菌的優(yōu)勢菌門豐度也存在顯著差異。不同茶園土壤樣品的優(yōu)勢門為變形菌門（Proteobacteria）(25.84%)，其次為酸桿菌門（Acidobacteria）(21.53%)。這兩個群體在土壤樣品中經常被發(fā)現[21]。Janssen等[22]的研究結果表明各種土壤中細菌門中數量最多的是變形菌門（Proteobacteria）(39%)和酸桿菌門（Acidobacteria）(19%)，雖然相對豐度比例不同，但與我們的結果一致。在處理后的OTP土壤樣品中，變形菌門（Proteobacteria）（24.97%）的相對豐度最高。Li等[23]指出β變形菌（β-Proteobacteria）是具有共生性并與大量可利用的營養(yǎng)物有關。這可能在一定程度上能解釋有機茶園土壤具有較高水平的細菌多樣性。此外，有機茶園土壤中硝化螺旋菌（Nitrospirae）的豐度明顯高于無公害和普通茶園。硝化螺旋菌（Nitrospirae）與氮循環(huán)密切相關，主要參與亞硝酸鹽向硝酸鹽的轉化，在土壤生物地球化學循環(huán)中具有不可替代的生態(tài)作用[24]。Martiny等[25]的研究表明，在生物膜和大體積水樣中，亞硝化體和亞硝化螺旋體都在硝化過程中發(fā)揮著重要的作用，能夠有效促進土壤中的氮循環(huán)；同時氮含量的增加可以為茶園土壤細菌的生長提供足夠的養(yǎng)分，從而提高茶園土壤細菌的多樣性。

3.3 不同管理模式對茶園土壤理化性質的影響

有機肥能改變土壤理化性質[26]，陳貴[30]、吳志丹[31]研究表明施用有機肥能顯著增加土壤的有機質、全氮、堿解氮、有效磷、總磷和速效鉀含量。楊君等[32]發(fā)現有機肥施用率高的茶園，其表層土壤中的磷含量高于其他施肥方式的茶園，有效磷的增加可以提高微生物多樣性[37]，提高茶園生產力[33]。pH值是影響土壤微生物群落結構的最強因素[38-39]，提高土壤pH對土壤微生物生物量和細菌群落多樣性具有積極意義[40]。有機肥料施用能改善土壤pH值[34-36]，為土壤提供了有機碳源增加微生物活性[29]，對土壤細菌多樣性產生積極影響[27-28]。本研究結果表明，3種管理模式中有機茶園TP、AP含量和pH值顯著高于其他兩種茶園，且土壤理化性質和細菌群落結構之間的關系分析也顯示，TP、AP和pH是影響茶園土壤細菌群落結構的主要土壤理化因子，與上述研究結果一致。