顧松松，胡秋龍，劉仲華，龔志華，李 適，譚 琳*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128）

土壤微生物在土壤物質(zhì)和能量的轉(zhuǎn)化、植物抗逆性、生長發(fā)育及生產(chǎn)力等方面發(fā)揮著極其重要的作用[1-2]。如根瘤菌（Rhizombiunm）和弗蘭克菌（Frankia）等固氮細(xì)菌可以提高作物產(chǎn)量，增加植物對氮元素的吸收[3]。假單胞菌（Pseudomonas）、芽孢桿菌（Bacillus）和農(nóng)桿菌（Agrobacterium）可通過產(chǎn)生植物激素或分子信號、競爭生長位點、鐵載體等促生長機(jī)制促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)對病原菌的抗性[4-5]。根際是直接受植物根系和分泌物影響的土壤區(qū)域，是土壤微生物與植物相互作用的重要場所。近年來，利用生物工程技術(shù)在分子水平上對植物土壤微生物多樣性的研究很多，但大多數(shù)主要集中在作物和森林[6-8]，對茶樹根際土壤微生物多樣性的研究報道較少。本文選取有機(jī)、無公害和普通等3種不同管理模式的茶園，研究茶樹根際土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，旨在為發(fā)揮微生物根際效益、調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)環(huán)境、改善土壤質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選取有機(jī)、無公害和普通等3種不同管理模式的茶園土壤，采樣地點分別為：有機(jī)茶園（湖南長沙縣茶園，OTP）、無公害茶園（湖南長沙望城茶園，NPTP）和普通茶園（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園，CTP），每個實驗茶園都大于666.7 m2。施肥和施藥：有機(jī)茶園2、9月份施腐熟的家畜糞尿、菜籽餅肥以及商品有機(jī)肥，全年施肥量為 250～350 kg/666.7 m2，施用生物農(nóng)藥；無公害茶園2、5、7、9月份施尿素和復(fù)合肥，全年施肥量為 80～100 kg/666.7 m2，施用化學(xué)農(nóng)藥為主；普通茶園2、9月份施尿素，全年施肥量為 80～100 kg/666.7 m2，施用化學(xué)農(nóng)藥。

依據(jù)《土壤分析技術(shù)規(guī)范》（2006）按“S”點位采集土樣。2017年8月，每個茶園取30個茶樹根際土壤樣品，每5個樣品充分混合后再仔細(xì)混勻，剔除石塊和雜物后堆成厚度均一的四方形，對角線法劃分成四等分，去掉對角線2份，依此方法重復(fù)操作，直到樣品重量達(dá)到所需，形成一個復(fù)合樣品。每個茶園采集6個土壤復(fù)合樣品，共計18個土壤復(fù)合樣品，一部分用于測定物理化學(xué)性狀，一部分用于分子實驗。用于分子試驗的土樣，密封儲存在-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 土壤理化性狀測定

土樣送中國科學(xué)院南京地理研究所土壤分析實驗室，檢測pH、總有機(jī)碳（TOC）、硝酸鹽氮（NO3-N）、氨氮（NH4-N）、總氮（TN）、有效磷（AP）和總磷（TP）。

1.3 DNA提取和擴(kuò)增子測序

使用 Fast DNA Spin 試劑盒（MP Biomedicals LLC，USA）提取各樣本總DNA。使用NanoDrop分 光 光 度 計（Nano-100，Aosheng Instrument Co Ltd.）測量 DNA 質(zhì)量和濃度。使用 515F（5'GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和 806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物并結(jié)合自行設(shè)計用以區(qū)分樣品的條形碼，將提取的DNA用作模板用于擴(kuò)增16SrRNA基因的V4區(qū)域。PCR擴(kuò)增在50 uL反應(yīng)體系中進(jìn)行，并使用凝膠提取試劑盒（D2500-02，OMEGA BioTek）純化 DNA。按照 VAHTS TM將所有樣品組合成單個樣品的文庫制備，使用MiSeq試劑盒制備用于測序的樣品文庫，送中南大學(xué)測序（Miseq測序儀）。

1.4 序列預(yù)處理和生物信息學(xué)方法

通過FLASH程序[9]將具有至少30 bp重疊長度的成對末端序列組合成全長序列，組合后平均片段長度為253 bp。通過Btrim程序[10]，將質(zhì)量得分閾值＞20或者5的設(shè)為窗口大小，用于篩選出不合格的序列。丟棄具有模糊堿基且僅保留245～260 bp范圍內(nèi)的序列作為靶向序列。UPARSE[11]用于去除嵌合體并將相似性為97%的序列分類為同一OUT（Optical Transform Unit）。將所有樣本作為列并且所有OTU作為行的大矩陣生成為OTU表，從該表獲得Resample OTU表以標(biāo)準(zhǔn)化總序列。所有序列預(yù)處理都是通過與這些生物信息學(xué)工具集成的內(nèi)部平臺（http：//mem.rcees.ac.cn：8080）進(jìn)行。

1.5 生態(tài)和統(tǒng)計分析

通過對Resample OUT表中觀察到的物種數(shù)量進(jìn)行計數(shù)得到Richness指數(shù)。使用Mothur程序[12]計算與稀釋曲線相關(guān)的Chao1值[13]。使用程序包（v.2.3-5）在R（v.3.2.5）中根據(jù)物種豐度計算Shannon和Inverse Simpson指數(shù)。基于Faith方法測量系統(tǒng)發(fā)育多樣性（PD），其是每個樣品中OTU的總系統(tǒng)發(fā)育分支長度的總和。使用PyNAST將所選代表性O(shè)TU序列與GreenGene數(shù)據(jù)集對齊，并使用FastTree程序生成發(fā)育樹文件。使用R中的Picante包（v.3.2.5）計算PD。UniFrac矩陣的主坐標(biāo)分析（PCoA）[14]用于微生物群落結(jié)構(gòu)變化。使用多變量方差分析（PERMANOVA）通過R（v.3.2.5）中的程序包（v.2.3-5）使用Bray-Curtis和Jaccard距離方法測試三組之間的差異。采用Pearson，Kendall和Spearman三種相關(guān)方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。通過雙尾t-test檢驗確定兩組之間的顯著性，并且使用單因素方差分析（ANOVA）獲得多組的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種類型茶園土壤的細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)差異性

通過高通量測序分析，從18個樣品中獲得了共419,685個有效序列，并且從序列中鑒定出17,403個OTU。3種茶園土壤OTU稀疏曲線趨于平緩，表明所測序列庫容都可以較好地反映細(xì)菌群落的種類與數(shù)量，基本涵蓋了3種茶園土壤中所有細(xì)菌種群，足以進(jìn)行下游數(shù)據(jù)分析（圖1）。通過細(xì)菌多樣性指數(shù)Chao1來比較不同管理模式的茶園土壤中細(xì)菌α多樣性。所有樣本的Chao1多樣性指數(shù)從3,042到6,200不等（圖2），表明3種茶園土壤均表現(xiàn)出高水平的細(xì)菌多樣性，有機(jī)茶園土壤具有最高水平的細(xì)菌多樣性；有機(jī)茶園與普通茶園、無公害茶園土壤的細(xì)菌α多樣性存在顯著差異（P＜0.05），普通茶園與無公害茶園土壤的細(xì)菌α多樣性無顯著差異?；?8個樣品中相對豐度較高（＞1%）的19個細(xì)菌菌群，在屬水平上進(jìn)行了分級聚類熱圖分析（圖3）。結(jié)果表明，無公害茶園和普通茶園的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成較為相似，與有機(jī)茶園存在顯著性差異。進(jìn)一步分析了不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌群落的β多樣性，細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析（PCoA）圖顯示，在3種管理模式下，茶園土壤組之間存在明顯的分離，有機(jī)茶園的細(xì)菌群落在第二軸上與另外兩個茶園細(xì)菌群落能明顯區(qū)分開，無公害茶園細(xì)菌群落在第一軸上與其他茶園細(xì)菌群落分離（圖4）?；贛RPP、ADONIS和PERMANOVA算法的差異檢驗結(jié)果也表明3種茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異（表1）。

表 1 不同茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性分析Table 1 Dissimilarity test of bacterial community structure in different tea plantation soils based on Bray-Curtis distance

圖1 不同茶園土壤細(xì)菌稀釋曲線（有機(jī)茶園土壤，OTP；無公害茶園土壤，NPTP；普通茶園土壤，CTP。下同）Fig. 1 Rarefaction curves of soil bacteria from different tea plantations

圖 2 不同茶園土壤細(xì)菌群落的Chao1指數(shù)Fig. 2 Chao1 index of bacterial community in different tea plantation soils

圖 3 不同茶園土壤主要細(xì)菌菌屬的聚類熱圖分析Fig. 3 Clustering heat map analysis of major generas in different tea plantation soils

圖 4 不同茶園土壤細(xì)菌群落的主坐標(biāo)軸(PCoA)分析Fig. 4 PCoA analysis of bacterial communities in different tea plantation soils

2.2 三種類型茶園土壤細(xì)菌群落組成差異性

3種茶園土壤的所有OTU被鑒定為36個門652個屬。3種茶園土壤細(xì)菌群落中的主要菌門（＞1%）共有13個，分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloro fl exi）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、齊古菌門（Thaumarchaeota）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、candidate division WPS-2、浮霉菌門（Planctomycetes）、藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和未分類菌門（Unclassi fied）（圖5a）。3種茶園土壤細(xì)菌群落中的主要菌屬（＞1%）共有19個，分別為未分類菌屬（Unclassi fied）、纖細(xì)桿菌屬（Ktedonobacter）、Gp2、Gp1、Gp3、亞硝基球藻菌屬（Nitrososphaera），第3子類：南方古陸屬（Subdivision3 generaincertae sedis）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、WPS-2南方苔蘚屬（WPS-2 genera incertae sedis）、短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、斯巴達(dá)菌（Spartobacteria）、Actinoallomurus、Gp6、共生桿菌（Conexibacter）、蓋伊拉菌屬（Gaiella）、芽單胞菌（Gemmatimonas）、鏈霉菌（Streptophyta）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和硝化螺菌屬（Nitrospira）（圖5b）。

3種茶園土壤的優(yōu)勢門類群相對豐度見表2。3種茶園樣本在5個菌門（變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、candidate division WPS-2、 浮 霉 菌 門（Planctomycetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）中所占比例差異顯著(P＜0.05)，其中有機(jī)茶園樣本和其他茶園樣本間差異尤其顯著(P＜0.05)。在相對豐度方面，有機(jī)茶園樣本具有最高的變形菌門（Proteobacteria）(24.97%)、疣微菌門（Verrucomicrobia）（6.84%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）（1.16%），而普通茶園樣本的浮霉菌門（Planctomycetes）豐度最高(2.16%)。將3種管理模式的茶園土壤樣品的OTU分布進(jìn)行維恩圖(Venn diagram)分析(圖6)可知，3種茶園樣本共有1,454個OUTs，在各自總OTU數(shù)量中占不同比例，分別為占有機(jī)茶園樣本OTU數(shù)量（6, 056個）的24.01%、占無公害茶園樣本OTU數(shù)（4,686個）的31.02%和占普通茶園樣本OTU數(shù)（4, 310個）的33.74%。3種茶園土壤樣本各自特有的OTU在各自總OTU數(shù)量中占不同比例，分別為有機(jī)茶園的56.29%、無公害茶園的37.81%和普通茶園的29.12%。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，即有機(jī)茶園管理模式下的土壤細(xì)菌群落組成與無公害茶園和普通茶園存在顯著差異。

圖 5 不同茶園土壤細(xì)菌群落主要菌門和屬的相對豐度Fig.5 Relative abundance of domain phyla and genera in bacterial communities of different tea plantation soils

圖 6 不同茶園土壤樣品OTU分布的Venn分析圖。圖中數(shù)據(jù)代表不同OTU數(shù)量。Fig. 6 Venn diagram of OTU distribution of different tea plantation soil samples. The data in the figure represents the number of OTU

2.3 三種類型茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

土壤樣品理化性質(zhì)測定結(jié)果見表3。其中TP、AP和NO3-N含量與pH值在三種茶園中存在顯著差異，有機(jī)茶園土壤TP含量最高，無公害茶園次之，普通茶園含量最低；硝態(tài)氮含量有機(jī)茶園與普通茶園差異不明顯，但都高于無公害茶園；有機(jī)茶園的AP含量與pH值為最高，無公害茶園與普通茶園差異不明顯。通過對茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子間的mantel test分析，結(jié)果表明TP、AP和pH是土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因子（表4）。

表2 不同茶園土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢門的相對豐度Table 2 Relative abundance of dominant phylum in tea plantation soil bacterial community under different management mode

表3 不同茶園土壤理化性質(zhì)Table 3 Soil properties of different tea plantations

表 4 不同茶園土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性的mantel test分析Table 4 Mantel test analysis on the correlation between environmental factors of different tea plantations and soil microbial community structure

3 討論

3.1 不同管理模式對茶園細(xì)菌多樣性的影響

本研究基于高通量測序技術(shù)對3種不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了初步研究，α多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，3種不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌多樣性有顯著性差異，且有機(jī)茶園多樣性顯著高于另外兩種管理模式下的茶園；β多樣性分析結(jié)果表明，有機(jī)、無公害以及普通茶園的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。土壤微生物種群的豐度和多樣性對土壤質(zhì)量、功能和土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性起著重要的作用。多樣性指數(shù)是評價細(xì)菌群落多樣性的重要指標(biāo)，多樣性指數(shù)越高表明細(xì)菌群落的豐富度和多樣性越高。袁紅朝[15]、徐永剛[16]研究表明施有機(jī)肥和秸稈還田均顯著增加土壤細(xì)菌多樣性。呂寧等[17]研究表明土壤細(xì)菌數(shù)量與物種豐度隨著生物農(nóng)藥施用量增加而顯著增加。張仕穎[19]、張雯雯[20]研究表明，施用化學(xué)農(nóng)藥會降低水稻田微生物群落的碳源利用能力，從而降低微生物多樣性。本研究結(jié)果顯示有機(jī)茶園中細(xì)菌群落的Chao1多樣性指數(shù)明顯高于另外兩個茶園，可能一方面是由于有機(jī)肥的施用，土壤有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀等可利用性增加，為更多的微生物提供了生長和繁殖的條件，從而土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)提高；另一方面，有機(jī)茶園中施用生物農(nóng)藥而非化學(xué)農(nóng)藥也是微生物多樣性提高的一個重要原因。

3.2 不同管理模式對茶園細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)的影響

本研究結(jié)果表明變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloro fl exi）在3種不同管理模式的茶園土壤細(xì)菌中都屬于優(yōu)勢菌群。從屬水平和OUT分布結(jié)果來看，有機(jī)茶園和無公害、普通茶園土壤有顯著差異性。無公害和普通茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中具有一定的同源性，但在低豐度的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面存在一定特異性，且細(xì)菌的優(yōu)勢菌門豐度也存在顯著差異。不同茶園土壤樣品的優(yōu)勢門為變形菌門（Proteobacteria）(25.84%)，其次為酸桿菌門（Acidobacteria）(21.53%)。這兩個群體在土壤樣品中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)[21]。Janssen等[22]的研究結(jié)果表明各種土壤中細(xì)菌門中數(shù)量最多的是變形菌門（Proteobacteria）(39%)和酸桿菌門（Acidobacteria）(19%)，雖然相對豐度比例不同，但與我們的結(jié)果一致。在處理后的OTP土壤樣品中，變形菌門（Proteobacteria）（24.97%）的相對豐度最高。Li等[23]指出β變形菌（β-Proteobacteria）是具有共生性并與大量可利用的營養(yǎng)物有關(guān)。這可能在一定程度上能解釋有機(jī)茶園土壤具有較高水平的細(xì)菌多樣性。此外，有機(jī)茶園土壤中硝化螺旋菌（Nitrospirae）的豐度明顯高于無公害和普通茶園。硝化螺旋菌（Nitrospirae）與氮循環(huán)密切相關(guān)，主要參與亞硝酸鹽向硝酸鹽的轉(zhuǎn)化，在土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中具有不可替代的生態(tài)作用[24]。Martiny等[25]的研究表明，在生物膜和大體積水樣中，亞硝化體和亞硝化螺旋體都在硝化過程中發(fā)揮著重要的作用，能夠有效促進(jìn)土壤中的氮循環(huán)；同時氮含量的增加可以為茶園土壤細(xì)菌的生長提供足夠的養(yǎng)分，從而提高茶園土壤細(xì)菌的多樣性。

3.3 不同管理模式對茶園土壤理化性質(zhì)的影響

有機(jī)肥能改變土壤理化性質(zhì)[26]，陳貴[30]、吳志丹[31]研究表明施用有機(jī)肥能顯著增加土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、總磷和速效鉀含量。楊君等[32]發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥施用率高的茶園，其表層土壤中的磷含量高于其他施肥方式的茶園，有效磷的增加可以提高微生物多樣性[37]，提高茶園生產(chǎn)力[33]。pH值是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的最強(qiáng)因素[38-39]，提高土壤pH對土壤微生物生物量和細(xì)菌群落多樣性具有積極意義[40]。有機(jī)肥料施用能改善土壤pH值[34-36]，為土壤提供了有機(jī)碳源增加微生物活性[29]，對土壤細(xì)菌多樣性產(chǎn)生積極影響[27-28]。本研究結(jié)果表明，3種管理模式中有機(jī)茶園TP、AP含量和pH值顯著高于其他兩種茶園，且土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系分析也顯示，TP、AP和pH是影響茶園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要土壤理化因子，與上述研究結(jié)果一致。