張雷

（四川勞研科技有限公司 四川攀枝花 617000）

1 前言

大腸埃希菌（革蘭氏陰性短桿菌），俗名大腸桿菌，周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌。大腸埃希菌的致病物質(zhì)之一是血漿凝固酶。根據(jù)致病性的不同，致瀉性大腸埃希菌被分為產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌、腸道侵襲性大腸埃希菌、腸道致病性大腸埃希菌、腸集聚性黏附性大腸埃希菌和腸出血性大腸埃希菌5種。部分埃希菌菌株與嬰兒腹瀉有關(guān)，并可引起成人腹瀉或食物中毒的暴發(fā)。

在實(shí)際工作中，常用到培養(yǎng)箱對各種樣品進(jìn)行培養(yǎng)分離，而不同原理的培養(yǎng)箱對大腸埃希菌的生長有不同的影響。其中，常用的培養(yǎng)箱有3類：隔水式培養(yǎng)箱、電熱式培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱。

隔水式培養(yǎng)箱是具有高精度的恒溫設(shè)備，其溫度波動(dòng)范圍為±0.5℃，可用于植物組織發(fā)芽、育苗、微生物的培養(yǎng)、昆蟲和小動(dòng)物的飼養(yǎng)、水質(zhì)檢測的生化需氧量（BOD）的測定及其他用途的恒溫試驗(yàn)，是生物遺傳工程、醫(yī)藥、農(nóng)、林、環(huán)境科學(xué)、畜牧、水產(chǎn)等生產(chǎn)、科研、教育部門的理想設(shè)備。

電熱式培養(yǎng)箱的外殼通常用石棉板或鐵皮噴漆制成，電熱式培養(yǎng)箱的夾層用石棉或玻璃棉等絕熱材料制成，以增強(qiáng)保溫效果，培養(yǎng)箱頂部設(shè)有溫度計(jì)，用溫度控制器自動(dòng)控制，使箱內(nèi)溫度恒定。直接電熱式培養(yǎng)箱采用的是用電熱絲直接加熱，利用空氣對流，使箱內(nèi)溫度均勻，其溫度波動(dòng)范圍為±2℃。

生化培養(yǎng)箱具有制冷和加熱雙向調(diào)溫系統(tǒng)，溫度可控的功能，其溫度波動(dòng)范圍為±2.5℃，是生物、遺傳工程、醫(yī)學(xué)、衛(wèi)生防疫、環(huán)境保護(hù)、農(nóng)林畜牧等行業(yè)的科研機(jī)構(gòu)、大專院校、生產(chǎn)單位或部門實(shí)驗(yàn)室的重要試驗(yàn)設(shè)備，廣泛應(yīng)用于低溫恒溫試驗(yàn)、培養(yǎng)試驗(yàn)、環(huán)境試驗(yàn)等試驗(yàn)過程中。生化培養(yǎng)箱控制器電路由溫度傳感器、電壓比較器和控制執(zhí)行電路組成。

雖然3種培養(yǎng)箱都可以培養(yǎng)大腸埃希菌，但是3種培養(yǎng)箱的加熱方式不一樣，溫度波動(dòng)范圍不同，對大腸埃希菌的生長有一定的影響。為使本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)論具有通用性和普遍性，本實(shí)驗(yàn)選擇了一株大腸埃希菌菌株作為研究對象[1]，將其接種到培養(yǎng)基中，放入不同的培養(yǎng)箱中，觀察培養(yǎng)箱的溫度波動(dòng)，研究其對大腸埃希菌生長的影響。

2 材料與方法

2.1 儀器

生物安全柜；電熱式培養(yǎng)箱（DH6000B，天津市泰斯特儀器有限公司）；隔水式培養(yǎng)箱（HENGZi，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；生化培養(yǎng)箱（SPX智能型，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司）。

2.2 試劑與材料

大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25922）；營養(yǎng)瓊脂（170103）；乳糖蛋白胨培養(yǎng)基（170517）；滅菌生理鹽水（201702140）。

2.3 方法

2.3.1 菌種的活化

將凍藏的大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株磁珠用接種環(huán)取出，用接種環(huán)把大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株磁珠在營養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線。把劃線的營養(yǎng)瓊脂平板放入（37±0.5）℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。

2.3.2 菌液的制備以及菌落的計(jì)數(shù)

挑取菌落到1 mL滅菌磷酸緩沖液中，制成1麥?zhǔn)媳葷岫鹊木鷳乙骸木鷳乙褐形?.5～4.5 mL滅菌生理鹽水中，制成1∶10的稀釋液，然后逐一10倍稀釋到10-7麥?zhǔn)媳葷岫取Ｈ?0-7麥?zhǔn)媳葷岫鹊南♂屢翰捎枚喙馨l(fā)酵法完成實(shí)驗(yàn)。取樣量分別為1 mL、0.1 mL、0.01 mL。每次試驗(yàn)做3份多管發(fā)酵法試驗(yàn)，共做7次。每次試驗(yàn)的3份多管發(fā)酵法試驗(yàn)分別放入隔水式培養(yǎng)箱、電熱培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱中，44.5℃培養(yǎng)24 h。同時(shí)吸取10-7麥?zhǔn)媳葷岫鹊南♂屢? mL，分別于2個(gè)平皿各1 mL，每個(gè)平皿傾注約15 mL已融化并冷卻到約45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使稀釋液與培養(yǎng)基充分混勻，待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，置于44.5℃培養(yǎng)內(nèi)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，共做7次。

2.3.3 溫度的記錄

從早上開始上班時(shí)記錄不同培養(yǎng)箱的的溫度，每隔1 h記錄一次。

3 結(jié)果與分析

3.1 精密度分析

3種培養(yǎng)箱的各個(gè)時(shí)間段的溫度見表1和圖1；在7次試驗(yàn)中，用得到的大腸埃希菌最大或然數(shù)（MPN數(shù)）做精密度分析。結(jié)果見表2。從表1、表2和圖1來看，隔水式培養(yǎng)箱的溫度波動(dòng)范圍小，結(jié)果值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為11.4%，相對穩(wěn)定；電熱式培養(yǎng)的溫度波動(dòng)范圍大，結(jié)果值的RSD為24.3%，相對較大；生化培養(yǎng)箱的溫度波動(dòng)范圍大，結(jié)果值的RSD為15.7%，相對較大。

3.2 t檢驗(yàn)分析

在7次試驗(yàn)中，用得到的大腸埃希菌MPN值與平皿的菌落數(shù)相比做t檢驗(yàn)分析。結(jié)果見表3。從表3可知，隔水式培養(yǎng)箱培養(yǎng)大腸埃希菌的MPN值與平皿菌落總數(shù)相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.807，P＞0.05）（t為樣品平均數(shù)與總體平均數(shù)的離差統(tǒng)計(jì)量；P為假設(shè)兩組比較無差異的概率）；電熱式培養(yǎng)箱和生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)大腸埃希菌的MPN值與平皿菌落總數(shù)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=2.700、5.004，P＜0.05）。

表1 3種培養(yǎng)箱的各個(gè)時(shí)間段的溫度

（續(xù)表1）

圖1 3種培養(yǎng)箱溫度波動(dòng)

4 討論

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，培養(yǎng)箱溫度的波動(dòng)情況對大腸埃希菌在的生長有很大的影響。使用溫度波動(dòng)范圍小的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，用多管發(fā)酵法得到的大腸埃希菌的MPN值的RSD值相對較小，結(jié)果值相對穩(wěn)定；同時(shí)用多管發(fā)酵法得到的大腸埃希菌的MPN值與平皿得到的菌落數(shù)相比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是在溫度波動(dòng)范圍大的時(shí)候，多管發(fā)酵法得到的大腸埃希菌的MPN值的RSD值相對較大，說明結(jié)果值不穩(wěn)定，可靠性不高；同時(shí)，在溫度波動(dòng)范圍大的時(shí)候，用多管發(fā)酵法得到的大腸埃希菌的MPN值與平皿得到的菌落數(shù)相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同樣也說明結(jié)果值不可靠。

表2 3種培養(yǎng)箱的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表3 3種培養(yǎng)箱的MPN值與平皿菌落數(shù)t檢驗(yàn)

綜上所述，培養(yǎng)箱是大腸埃希菌生長繁殖的良好場所[2]，但是溫度波動(dòng)大小對大腸埃希菌的生長有很大的影響，溫度波動(dòng)太大時(shí)，得到的結(jié)果值的可靠性不高。因此，在對分離培養(yǎng)大腸埃希菌時(shí)，應(yīng)盡量選擇溫度波動(dòng)范圍較小的培養(yǎng)箱。