賀娟，丁見，王馨珂，燕群，賴秋華，李愛民，劉思德

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)在全球及國內(nèi)發(fā)病率均逐年上升[1-2]，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積是NAFLD形成的初始形式[3]，并可進(jìn)一步誘發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥因子的活化，致使細(xì)胞內(nèi)失衡及損傷[4-5]。腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)在肝臟組織中也存在，并可參與NAFLD疾病進(jìn)程[6-8]。RAS系統(tǒng)包含經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ 1型受體(ACE-AngⅡ-AT1-R)軸及新近發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2-血管緊張素(1-7)-血管緊張素(1-7)受體(ACE2-Ang(1-7)-Mas軸)，ACE2-Ang(1-7)-Mas軸被認(rèn)為是ACE-AngⅡ-AT1-R軸的內(nèi)在反饋調(diào)節(jié)軸。AngⅡ可加重肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積及細(xì)胞損傷[9]，可促進(jìn)NAFLD進(jìn)展[10]；Ang(1-7)對肝細(xì)胞的作用目前研究尚少[11]。本研究選用人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞系，建立脂肪累積模型，研究Ang(1-7)對肝細(xì)胞脂質(zhì)累積及損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常肝細(xì)胞L-02細(xì)胞系購自ATCC； DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、血清購自Gibco；棕櫚酸、油酸 、Ang(1-7)、DCFH-DA探針購自Sigma-Aldrich；DHE探針購自碧云天；LC3B抗體購自Cell Signaling Technology；GAPDH抗體購自Proteintech；自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP- GFP-virus)購自漢恒生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞以10% FBS完全培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期進(jìn)行換液，培養(yǎng)至所需細(xì)胞濃度進(jìn)行相應(yīng)藥物處理。

1.2.2 藥物配置

游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)以棕櫚酸∶油酸=1∶2濃度配置。步驟如下：①10.1 mg 油酸鈉, 4.6 mg棕櫚酸鈉加入6 mL雙蒸水，70 ℃水浴15～20 min；②1.1 g脫脂BSA 加入5 mL 雙蒸水，37 ℃水浴溶解；③將脂肪酸溶液與39 mL DMEM混勻，再加入BSA溶液。即50 mL 1 mmol/L的FFA溶液，過濾后用于細(xì)胞。作用于細(xì)胞時配置成0.5 mmol/L FFA溶液。

1.2.3 分組及處理

分組：①正常對照組(Control)： 以正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；②FFA組：0.5 mmol/L游離脂肪酸干預(yù)24 h；③ FFA+Ang(1-7)10-9mol/L組：0.5 mmol/L游離脂肪酸與10-9mol/L Ang(1-7)共同干預(yù)24 h； ④FFA+Ang(1-7)10-7mol/L組：0.5 mmol/L游離脂肪酸與10-7mol/L Ang(1-7)共同干預(yù)24 h；⑤FFA+Ang(1-7)10-5mol/L組：0.5 mmol/L游離脂肪酸與10-9mol/L Ang(1-7)共同干預(yù)24 h；將細(xì)胞接種到6孔板(1×106個/孔)，待細(xì)胞貼壁后按照分組依次進(jìn)行相應(yīng)刺激，并進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2.4 油紅染色

將細(xì)胞接種到24孔板，爬片上予以藥物刺激；將爬片放于配好的油紅O染液中，靜置30 min后用自來水清洗。爬片放于蘇木素染液中，靜置40 s后用自來水清洗，返藍(lán)1 min。甘油明膠封片，正置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞氧化應(yīng)激ROS測定

將細(xì)胞種植于96孔板中，設(shè)置復(fù)孔，予藥物刺激后，棄上清，以PBS清洗3次；預(yù)先用DMEM 以1∶1 000稀釋DCFH-DA及DHE探針，以每孔200 μL加入相應(yīng)探針，37 ℃孵育 30 min；棄去探針，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.2.6 自噬雙標(biāo)病毒轉(zhuǎn)染及熒光染色

將細(xì)胞接種在24孔板爬片上，細(xì)胞密度為 40%～50%時更換為無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3病毒(MOI=50)，2 h后更換完全培養(yǎng)基，并加入藥物刺激，多聚甲醛固定10 min后封片，熒光顯微鏡下拍照觀察，拍照計數(shù)并統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果以Mean±SEM表示，采用Graphpad Prism 5進(jìn)行方差分析，組間比較采用非配對T檢驗進(jìn)行差異分析，并將P<0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 Ang(1-7)可緩解FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積

0.5 mmol/L FFA可明顯增加人正常肝細(xì)胞L-02內(nèi)脂質(zhì)沉積水平，且在L-02細(xì)胞中脂滴更為明顯。以三個不同濃度Ang(1-7)與FFA共同作用于肝細(xì)胞，結(jié)果提示Ang(1-7)能明顯緩解FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積水平，且隨著Ang(1-7)濃度的增加緩解脂質(zhì)水平的能力增強。10-7mmol/L及10-5mmol/L可大幅緩解脂質(zhì)沉積，其中10-5mmol/L基本可以逆轉(zhuǎn)FFA所致的脂肪累積至正常肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平，見圖1。

2.2 Ang(1-7)可緩解FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激

2.3 Ang(1-7)可上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)自噬水平，調(diào)節(jié)脂類代謝

本研究采用自噬雙標(biāo)腺病毒mRFP-GFP-virus轉(zhuǎn)染L-02細(xì)胞后觀察自噬小體及自噬溶酶體形成的自噬流，結(jié)果顯示：FFA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積的肝細(xì)胞內(nèi)自噬水平相較正常肝細(xì)胞內(nèi)略有上升(自噬溶酶體(紅)P=0.047 4, 自噬小體(黃)P=0.013 2)。而相較FFA組，Ang(1-7)則可明顯激活上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬溶酶體水平。其中，10-9mol/L Ang(1-7)即可輕度上調(diào)自噬小體(P=0.000 6)，并顯著上調(diào)溶酶體水平(P=0.024 1)，10-7mol/L Ang(1-7)與10-5mol/L Ang(1-7)可顯著上調(diào)自噬小體(10-7mol/L，P<0.000 1；10-5mol/L，P<0.000 1)，及自噬溶酶體(10-7mol/L，P=0.007 5；10-5mol/L，P=0.002 9)，見圖4。

圖2 Ang(1-7)對FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。DCFH-DA探針染色肝細(xì)胞，并于熒光顯微鏡下拍照觀察，×200倍

圖3 Ang(1-7)對FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)水平的影響。DHE探針染色肝細(xì)胞，并于熒光顯微鏡下拍照觀察，×200倍

A為自噬小體及自噬溶酶體熒光圖，紅色為自噬溶酶體，黃色為自噬小體。B、C為細(xì)胞內(nèi)自噬小體及自噬溶酶體數(shù)目統(tǒng)計分析。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

3 討論

NAFLD病理學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，肝細(xì)胞是NAFLD進(jìn)展過程中最關(guān)鍵也是受損最嚴(yán)重的細(xì)胞[12]。肝細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)沉積誘發(fā)氧化應(yīng)激，后者可致使肝細(xì)胞損傷甚至壞死[13]。ACE2-Ang(1-7)-Mas軸是對ACE-AngⅡ-AT1-R內(nèi)在反饋機制，Ang(1-7)是其主要活性成分，由ACE2水解AngⅡ及AngI生成，可結(jié)合特異性受體Mas，拮抗AngⅡ作用[8]。本課題組前期實驗證實AngⅡ可加重肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，因此本研究進(jìn)一步研究Ang(1-7)對FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的影響，借此進(jìn)一步完善RAS系統(tǒng)在肝臟脂質(zhì)代謝的作用。本研究結(jié)果表明，游離脂肪酸作用于肝細(xì)胞可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞脂質(zhì)明顯沉積，胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)上調(diào)，ROS水平明顯增強。Ang(1-7)可緩解FFA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，同時可降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，減輕FFA導(dǎo)致的肝細(xì)胞功能失調(diào)。

細(xì)胞自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)的一種自食(self-eating)現(xiàn)象，依賴溶酶體途徑對胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行吞噬、包被、融合的過程，以實現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[14-15]，與多種疾病相關(guān)[16]。自噬可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平[17]，緩解細(xì)胞脂質(zhì)累積；細(xì)胞內(nèi)自噬被激活以吞噬脂滴[18]，進(jìn)而降低脂類對細(xì)胞所造成的損傷[19]；但過量脂質(zhì)累積可抑制自噬。自噬也可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，降低ROS水平[20]。自噬在NAFLD疾病起調(diào)控作用[21]，而關(guān)于Ang(1-7)調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞內(nèi)自噬水平以實現(xiàn)其對細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的研究較少。本課題組前期實驗表明AngⅡ可加強FFA所致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，而過量脂質(zhì)沉積后肝細(xì)胞自噬下降。本研究結(jié)果證實Ang(1-7)可上調(diào)FFA誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積的肝細(xì)胞內(nèi)自噬水平，促進(jìn)自噬調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，從而緩解細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)累積。脂質(zhì)的累積可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平上調(diào)，Ang(1-7)可通過促進(jìn)自噬反饋降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。

綜上所述，Ang(1-7)可在細(xì)胞水平上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)自噬水平，進(jìn)而降低脂質(zhì)累積及氧化應(yīng)激水平，緩解FFA所致的肝細(xì)胞功能損傷及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失調(diào)，可以保護(hù)肝細(xì)胞，由NAFLD狀態(tài)逆轉(zhuǎn)為基本正常狀態(tài)，這可能為Ang(1-7)介導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)自噬作為防治NAFLD進(jìn)展提供新的防治思路及理論依據(jù)。