王濤，彭濤，溫曉雪，王剛，張首國，王林

1.北京工業(yè)大學 生命科學與生物工程學院，北京100124；

2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 輻射醫(yī)學研究所，北京100850

Polo樣激酶（Polo-like kinases，Plks）是一類結構和功能高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，包括Plk1、Plk2（SNK）、Plk3（FNK或PRK）、Plk4（SAK）和Plk5共5種亞型，在細胞有絲分裂中發(fā)揮至關重要的作用[1]。對Plks家族中Plk1的研究最為廣泛。Plk1除了控制細胞有絲分裂以外，還在中心體成熟、調節(jié)微管組織等過程中起重要作用[2]。研究發(fā)現Plk1在多種人類腫瘤細胞，包括乳腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌等中呈過表達狀態(tài)，但在正常組織中的表達很少[3]。因此Plk1被確定為癌癥診斷和預后的標志分子，成為腫瘤治療的有效靶點之一。

ON 01910（圖1）是Onconava公司研發(fā)的抗腫瘤藥物，屬于非ATP競爭性Plk1小分子抑制劑，半抑制濃度（IC50）為9～10 nmol/L，通過與酶底物結合位點直接結合，導致細胞多級紡錘體和中心體異常，使細胞分裂阻滯在G2/M期，最終誘導腫瘤細胞凋亡[4]。研究表明，ON 01910對多種人類腫瘤細胞株（包括多種耐藥細胞株）具有廣譜抑制活性，IC50為50～250 nmol/L[5]。ON 01910的 鈉鹽Rigosertib當前處于Ⅲ期臨床研究階段。

計算機輔助藥物設計通過模擬小分子配體與生物大分子受體的結構，計算配體與受體之間的相互作用模式和結合親和力，達到合理設計或改造藥物分子的目的。分子對接是計算機輔助藥物設計中應用最廣泛的研究方法：將小分子配體對接到受體的活性口袋，并搜索合理的取向和構象，使得它們之間的形狀和相互作用達到最佳匹配[6]，并同時參考打分情況（即計算小分子-生物大分子的結合自由能），評價、比較化合物結構的優(yōu)劣。計算機輔助藥物設計在藥物研發(fā)實際應用中取得了很大成就，如HIV整合酶抑制劑的設計[7-8]、PI3K抑制劑的設 計[9-10]、Bcl-2蛋白抑 制劑的設計[11-12]等。

本研究中，我們以ON 01910為先導化合物，結合其同類化合物的構效關系規(guī)律，利用生物電子等排原理，設計出16個芐砜2-喹諾酮類化合物（圖2）。采用計算機輔助軟件Autodock將此16個化合物與Plk1進行虛擬篩選和分子對接，對結果進行簇分析，驗證化合物結構設計的合理性。最終合成了目標化合物，獲得了理化常數，并對結構進行了確證。

1 材料與方法

1.1 材料

各種試劑均為分析純（北京伊諾凱科技有限公司，國藥集團化學試劑公司，Acros公司）；RP5002K型電子分析天平（常州銳品精密儀器有限公司）；RY-1型熔點儀（溫度未經校正，天津市天分分析儀器廠）；JNM-ECA-400超導核磁共振波譜儀（日本電子株式會社）；RE-52型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 分子對接

從Protein Data Bank（PDB庫，http://www.rcsb.org）下載Plk1（2RKU）的受體蛋白。蛋白結構的預處理在Discovery Studio 2.5軟件中進行，去除受體蛋白中的內源性配體和一些不必要的水分子、金屬離子，加氫，結構優(yōu)化；同時對設計的化合物進行加氫和結構優(yōu)化。采用Autodock軟件進行分子對接，每個化合物生成100種構象，選取打分最高的構象進行簇分析，以結合自由能（bind?ing energy）進行打分。

1.3 化合物的合成

圖1 ON 01910的結構式

圖2 芐砜2-喹諾酮類化合物結構通式

1.3.1 目標化合物的合成路線以取代的氯芐或溴芐為起始原料，先與巰基乙酸發(fā)生取代反應得到中間體2a～2h，然后被雙氧水氧化為芐基磺酰基乙酸3a～3h，再與（間甲氧基）苯胺發(fā)生?；磻玫街虚g體4a～4p，最后經環(huán)化縮合、水解反應得到目標化合物6a～6p（合成路線見圖3）。

1.3.2 中間體2a～2h的合成通法[13]（以2a為例）稱取2.20 g（55 mmol）氫氧化鈉，溶于25 mL無水甲醇，冰浴條件下加入2.53 g（27.5 mmol）巰基乙酸和6.25 g（25 mmol）3-溴溴芐（1a），溶液逐漸變?yōu)槿榘咨? h反應完全。減壓蒸除甲醇，所得白色固體溶于80 mL水，滴加稀鹽酸至pH2.0，有大量白色固體析出。減壓抽濾、水洗、干燥得5.98 g白色固體2a，產率91.7%，m.p.87～89℃。無須純化，直接投入下一步反應。

同法分別以1b～1h代替1a制得中間體2b～2h。2b，產率91.2%，m.p.73～76℃；2c，產率72.6%，液 體；2d，產 率94.6%，m.p.49～51℃；2e，產 率96.1%，m.p.63～66℃；2f，產率98.5%，液體；2 g，產率94.8%，液體；2 h，產率64.3%，液體。

1.3.3 中間體3a～3h的合成通法[14]（以3a為例）稱取3.52 g（13.5 mmol）3-溴芐硫基乙酸（2a）溶于15 mL冰醋酸，冰浴條件下滴加5.4 mL（54.0 mmol）30%過氧化氫溶液。室溫攪拌10 min后55℃油浴加熱反應，4 h反應完全。反應液倒入150 mL冰水中，有固體析出，抽濾、洗滌、干燥得3.39 g白色固體3a，產率85.8%，m.p.179～181℃。無須純化，直接投入下一步反應。

同法分別以2b～2h代替2a制得中間體3b～3h。3b，產 率87.7%，m.p.177～179℃；3c，產 率70.0%，m.p.133～135℃；3 d，產率78.7%，m.p.175～177℃；3e，產率89.7%，m.p.161.5～163℃；3f，產率58.9%，m.p.134.5～136℃；3 g，產率60.5%，m.p.160～164℃；3 h，產率73.5%，m.p.157～159℃。

1.3.4 中間體4a～4p的合成通法[15]（以4a為例）稱取2.49 g（10 mmol）中間體3a和0.93 g（10 mmol）苯胺，懸浮于50 mL二氯甲烷，冰浴條件下相繼加入0.06 g DMAP和2.11 g EDCI（11 mmol）。室溫下1 h反應完全，加入30 mL二氯甲烷進行稀釋，依次用飽和碳酸鈉水溶液（30 mL×2）、稀鹽酸（30 mL×1）和飽和氯化鈉水溶液（30 mL×1）洗滌，無水硫酸鈉干燥。蒸除溶劑得3.21 g白色固體4a，產率87.2%，m.p.173～175℃。無須純化，直接投入下一步反應。

同法以3b～3h代替3a分別與苯胺和對甲氧基苯胺反應，制得中間體4b～4p。4b，產率90.7%，m.p.203～205℃；4c，產率88.4%，m.p.111～113℃；4 d，產率91.3%，m.p.146～148℃；4e，產率87.3%，m.p.141～143℃；4f，產率81.0%，m.p.53～55℃；4g，產率83.2%，m.p.176～178℃；4 h，產率87.7%，m.p.177～179℃；4i，產 率88.0%，m.p.213～215℃；4j，產 率81.1%，m.p.221～224℃；4k，產率78.3%，m.p.167～169℃；4l，產率88.7%，m.p.175～177℃；4m，產率89.5%，m.p.145～147℃；4n，產率88.4%，m.p.137～139℃；4o，產率80.6%，m.p.191～193℃；4p，產率81.5%，m.p.169～171℃。

（iii）假定群決策問題的決策標準集為U={u1，u2，…，um}，且有標準的權重向量為w=（w1，w2，…，

圖3 目標化合物（6a～6p）的合成路線

1.3.5 中間體5a～5p的合成通法[16]（以5a為例）量取2 mL DMF，冰浴條件下緩慢滴加10 mL三氯氧磷，0.5 h后緩慢加入1.19 g（3 mmol）中間體4a，室溫攪拌15 min后75℃加熱反應，4 h反應完全。反應液倒入80 mL冰水中，有黃色固體析出，用二氯甲烷（25 mL×3）萃取，合并有機相，飽和氯化鈉水溶液（20 mL×1）洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離（石油醚∶乙酸乙酯3∶1）得0.29 g白色固體5a，產率21.7%，m.p.176～178℃。

同法分別以4b～4p代替4a制得中間體5b～5p。5b，產 率21.5%，m.p.254～256℃；5c，產 率24.7%，m.p.154～156℃；5d，產率21.8%，m.p.191～193℃；5e，產 率22.9%，m.p.165～167℃；5f，產 率21.6%，m.p.167～169℃；5 g，產率25.1%，m.p.200～202℃；5 h，產率25.3%，m.p.218～220℃；5i，產率22.8%，m.p.185～187℃；5j，產 率28.3%，m.p.239～241℃；5k，產 率23.9%，m.p.168～170℃；5l，產 率22.0%，m.p.196～198℃；5m，產率23.7%，m.p.196～198℃；5n，產率23.6%，m.p.193～195℃；5o，產 率29.1%，m.p.198～200℃；5p，產率26.0%，m.p.207～209℃。

1.3.6 目標化合物6a～6p的合成通法[17]（以6a為例）稱取0.19 g（0.45 mmol）中間體5a懸浮于10 mL冰醋酸中，加入2 mL 2 mol/L鹽酸，加熱回流，原料逐漸溶解，24 h反應完全。反應液冷卻至室溫，倒入80 mL冰水中，有固體析出，用二氯甲烷萃?。?5 mL×2），合并、水洗，柱層析分離（石油醚∶乙酸乙酯1∶1）得0.10 g黃色固體6a，產率66.2%，m.p.249～251℃。

同法分別以5b～5p代替5a制得目標化合物6b～6p。6b，產率54.9%，m.p.308～310℃；6c，產率50.5%，m.p.221～223℃；6d，產率52.4%，m.p.304～306℃；6e，產 率52.7%，m.p.252～254℃；6f，產 率53.0%，m.p.286～288℃；6 g，產率57.8%，m.p.249～251℃；6 h，產率55.6%，m.p.240～242℃；6i，產率55.0%，m.p.275～277℃；6j，產 率52.4%，m.p.280～282℃；6k，產 率52.7%，m.p.209～211℃；6l，產 率55.7%，m.p.＞300℃；6m，產 率55.6%，m.p.267～269℃；6n，產 率58.6%，m.p.＞300℃；6o，產 率59.3%，m.p.273～275℃；6p，產率57.8%，m.p.254～256℃。結構測試數據見正文2.2部分。

2 結果

2.1 目標化合物與Plk1的分子對接結果

從化合物與Plk1的結合作用模式（圖4）可以看出，設計的化合物6m結構中磺?；⊿O2）的2個氧原子均能與結合位點的氨基酸殘基Phe A64形成氫鍵；2-喹諾酮片段中酰胺的羰基氧分別與Lys A82形成氫鍵、與Gly A196形成范德華力，氨基氫原子能與Asp A84形成氫鍵。綜合上述兩因素，化合物6m分子中2-喹諾酮磺酰基片段與Plk1之間存在更多的作用力，使得整個分子結構與Plk1的結合力更強，對接效果優(yōu)于先導化合物ON 01910。

小分子化合物與蛋白分子結合的自由能越小、抑制常數越小，則表示兩者之間的結合力越強，結合越緊密。簇分析結果（表1）表明，設計的化合物中有15個與Plk1的結合自由能和抑制常數均比ON 01910的小，與Plk1的結合力均有明顯提升，表明化合物結構設計是合理的?；衔?m與Plk1的結合自由能最小，為-6.52 kcal/mol，即與Plk1的結合最緊密。

圖4 ON 01910（A）、化合物6m（B）與Plk1的結合模式

2.2 化合物的結構鑒定：

核磁共振氫譜（1H-NMR）數據與目標化合物結構一致，證實所得化合物結構正確。

6b：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：4.90（s，2H，-CH2），7.24（d，J=8.8 Hz，2H，Ar-H），7.28（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.41（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.54（d，J=8.8 Hz，2H，Ar-H），7.70（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.93（d，J=6.8 Hz，1H，Ar-H），8.55（s，1H，=CH-），12.59（s，1H，-NH-CO-）。

6c：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.66（s，3H，-OCH3），4.86（s，2H，-CH2），6.86（t，J=8.0 Hz，3H，Ar-H），7.21（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.27（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.40（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.70（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.91（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），8.54（s，1H，=CH-），12.58（s，1H，-NH-CO-）。

表1 化合物與Plk1分子對接簇分析結果

6d：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.06（s，2H，-CH2），7.25～7.31（m，2H，Ar-H），7.37（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.40～7.44（m，2H，Ar-H），7.64（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.72（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.95（d，J=6.8 Hz，1H，Ar-H），8.58（s，1H，=CH-），12.58（s，1H，-NH-CO-）。

6e：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：4.94（s，2H，-CH2），7.10（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.14（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.17（d，J=2.0 Hz，1H，Ar-H），7.28（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.37（q，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.41（d，J=8.4 Hz，1H，Ar-H），7.70（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.92（d，J=6.8 Hz，1H，Ar-H），8.56（s，1H，=CH-），12.59（s，1H，-NHCO-）。

6f：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：4.95（s，2H，-CH2），7.16（d，J=2.4 Hz，1H，Ar-H），7.19（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.28（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.35～7.40（m，2H，Ar-H），7.42（d，J=8.4 Hz，1H，Ar-H），7.71（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.93（d，J=6.8 Hz，1H，Ar-H），8.55（s，1H，=CH-），12.58（s，1H，-NH-CO-）。

6g：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：4.90（s，2H，-CH2），7.16（t，J=8.4 Hz，2H，Ar-H），7.27（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.33（t，J=8.4 Hz，2H，Ar-H），7.41（d，J=8.4 Hz，1H，Ar-H），7.70（t，J=8.4 Hz，1H，Ar-H），7.92（d，J=6.8 Hz，1H，Ar-H），8.54（s，1H，=CH-），12.58（s，1H，-NH-CO-）。

6h：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.68（s，3H，-OCH3），4.81（s，2H，-CH2），6.87（d，J=8.4 Hz，2H，Ar-H），7.19（d，J=8.4 Hz，2H，Ar-H），7.27（t，J=8.4 Hz，1H，Ar-H），7.40（d，J=8.4 Hz，1H，Ar-H），7.69（t，J=8.4 Hz，1H，Ar-H），7.91（d，J=6.8 Hz，1H，Ar-H），8.52（s，1H，=CH-），12.56（s，1H，-NH-CO-）。

6i：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.76（s，3H，-OCH3），4.90（s，2H，-CH2），7.16（t，J=8.8 Hz，2H，Ar-H），7.32（t，J=8.0 Hz，2H，Ar-H），7.36（d，J=2.0 Hz，2H，Ar-H），7.49（s，1H，Ar-H），8.47（s，1H，=CH-），12.50（s，1H，-NH-CO-）。

6j：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.76（s，3H，-OCH3），4.90（s，2H，-CH2），7.23（d，J=8.4 Hz，2H，Ar-H），7.36（d，J=2.0 Hz，2H，Ar-H），7.49（s，1H，Ar-H），7.53（d，J=8.4 Hz，2H，Ar-H），8.47（s，1H，=CH-），12.51（s，1H，-NH-CO-）。

6k：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.66（s，3H，-OCH3），3.75（s，3H，-OCH3），4.87（s，2H，-CH2），6.84（t，J=8.0 Hz，3H，Ar-H），7.21（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.35（s，2H，Ar-H），7.49（s，1H，Ar-H），8.47（s，1H，=CH-），12.50（s，1H，-NHCO-）。

6l：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.76（s，3H，-OCH3），4.95（s，2H，-CH2），7.09（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.15（t，J=8.0 Hz，2H，Ar-H），7.33～7.38（m，3H，Ar-H），7.50（s，1H，Ar-H），8.49（s，1H，=CH-），12.52（s，1H，-NH-CO-）。

6m：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.76（s，3H，-OCH3），5.06（s，2H，-CH2），7.27（t，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），7.35～7.40（m，4H，Ar-H），7.52（s，1H，Ar-H），7.64（d，J=8.0 Hz，1H，Ar-H），8.52（s，1H，=CH-），12.50（s，1H，-NH-CO-）。

6n：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.76（s，3H，-OCH3），4.94（s，2H，-CH2），7.21（d，J=3.2 Hz，1H，Ar-H），7.32～7.40（m，5H，Ar-H），7.50（s，1H，Ar-H），8.50（s，1H，=CH-），12.54（s，1H，-NH-CO-）。

6o：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.76（s，3H，-OCH3），4.93（s，2H，-CH2），7.26（q，2H，Ar-H），7.36（d，J=2.0 Hz，2H，Ar-H），7.51（d，3H，Ar-H），8.51（s，1H，=CH-），12.54（s，1H，-NHCO-）。

6p：1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.68（s，3H，-OCH3），3.75（s，3H，-OCH3），4.82（s，2H，-CH2），6.86（d，J=8.8 Hz，2H，Ar-H），7.18（d，J=8.8 Hz，2H，Ar-H），7.34（s，2H，Ar-H），7.48（s，1H，Ar-H），8.45（s，1H，=CH-），12.48（s，1H，-NH-CO-）。

3 討論

Plk1是抗腫瘤藥物研發(fā)的關鍵靶點，近年來文獻報道了多個Plk1小分子抑制劑，有一些已進入臨床研究階段，但迄今尚無Plk1抑制劑獲準上市。本研究以ON 01910為先導化合物，運用生物電子等排原理，設計了16個芐砜2-喹諾酮類化合物，其中15個為新化合物。利用計算機輔助設計軟件分析了此16個化合物與Plk1蛋白的結合方式及穩(wěn)定性，結果表明與ON 01910相比，該類化合物與Plk1的結合更穩(wěn)定，從理論上證實了該類化合物結構設計的合理性?；衔飳lk1的抑制活性有待通過實體篩選實驗進行評價。目標化合物的合成路線簡便，條件溫和，試劑易得。以上結果為新型Plk1抑制劑的設計合成提供了理論參考，也為芐砜2-喹諾酮類化合物的結構優(yōu)化和活性評價奠定了基礎。