齊連權(quán)，劉利波

北京泰德制藥股份有限公司，北京100176

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是McCord和Fridovich于1969年發(fā)現(xiàn)的具有歧化超氧陰離子酶活性的蛋白[1]，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成過(guò)氧化氫和氧氣，同時(shí)消耗2個(gè)氫離子，從而清除超氧陰離子自由基。超氧自由基介導(dǎo)損傷的一類主要疾病是缺血再灌注損傷[2-3]。各種原因造成組織血液灌流量減少，可使細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，表現(xiàn)為膜電位改變、細(xì)胞腫脹、細(xì)胞骨架紊亂、ATP減少、細(xì)胞酸中毒、離子泵失靈等。

近年來(lái)，臨床上采用心臟外科體外循環(huán)等治療方法，使組織器官缺血后重新得到血液再灌注，把疾病治療提高到一個(gè)新的水平。但缺血再灌注時(shí)炎性細(xì)胞和損傷的線粒體等會(huì)產(chǎn)生大量超氧自由基，這些超氧自由基如果不能被盡快歧化清除至正常生理濃度，就會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白氧化和DNA損傷[4]。在體內(nèi)負(fù)責(zé)清除超氧自由基的酶是SOD，研究發(fā)現(xiàn)Cu/Zn-SOD最具臨床應(yīng)用前景，目前已有眾多科研機(jī)構(gòu)開展以Cu/Zn-SOD為治療藥物的多項(xiàng)臨床前和臨床試驗(yàn)。但由于SOD分子較低的細(xì)胞膜親和性和較短的消除半衰期，使得這些臨床試驗(yàn)多數(shù)以失敗告終，或者與臨床前試驗(yàn)結(jié)果有較大背離[5-7]。也有很多研究機(jī)構(gòu)采用基因治療手段對(duì)SOD分子進(jìn)行改造或設(shè)計(jì)出新的藥物輸送系統(tǒng)，試圖改變其細(xì)胞親和性及體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)活性，相應(yīng)的臨床前和臨床試驗(yàn)顯示了較好的應(yīng)用前景[8-10]。本研究涉及的磷脂化SOD（lecithinized SOD，PC-SOD）可能是其中進(jìn)展較快、藥效學(xué)較好的一種。PCSOD是磷脂化的重組人Cu/Zn-SOD，即在每個(gè)SOD二聚體分子上平均結(jié)合4分子的磷脂酰膽堿衍生物[11-12]。我們希望通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)明確磷脂化修飾是否會(huì)增強(qiáng)SOD分子的細(xì)胞親和力，從而為PC-SOD成藥研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human coronary ar?tery endothelial cell，HCAEC）、人心肌細(xì)胞（hu?man cardiac myocytes，HCM）購(gòu)自ScienCell公司；重組人SOD（批號(hào)：P100305；蛋白濃度49.8 mg/mL）、PC-SOD（批號(hào)：S100305；蛋白濃度89.81 mg/mL）樣品由北京泰德制藥股份有限公司提供。

胎牛血清（FBS）（Hyclone）；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、心肌細(xì)胞培養(yǎng)基（ScienCell）；SOD單克隆抗體、細(xì)胞固定和透化液、細(xì)胞透化和洗滌液（BD Biosci?ence）；FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（Santa Cruz）；ECL Plus蛋白印跡檢測(cè)試劑盒（GE）；Alexa Fluor 594標(biāo)記的小麥胚芽凝集素（Invitrogen）；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

BD Bioscience Calibur流式細(xì)胞儀（軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所）；Carl Zeiss LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡（軍事醫(yī)學(xué)研究院儀器分析測(cè)試中心）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

凍存的HCAEC和HCM按常規(guī)方法復(fù)蘇，分別培養(yǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中。

1.3 細(xì)胞的藥物處理

處理前1 d，將細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于6孔板，每孔約5×105細(xì)胞。處理前，用相應(yīng)的培養(yǎng)基將PCSOD和SOD稀釋至100μg/mL，小心吸出孔中的培養(yǎng)液，加入1 mL含已稀釋藥物的培養(yǎng)基。PCSOD孵育時(shí)間點(diǎn)分別為0.5、1、2和3 h，SOD孵育時(shí)間為2 h。藥物孵育完畢，細(xì)胞即可進(jìn)行相應(yīng)的后繼處理和分析。

1.4 細(xì)胞染色及流式細(xì)胞術(shù)分析

藥物處理完畢，制備單細(xì)胞懸液，用含1%FBS的PBS洗滌1次，棄凈上清后加入250μL細(xì)胞固定和透化液，避光處理20 min；再用細(xì)胞透化和洗滌液洗滌1次，加入50μL用細(xì)胞透化和洗滌液稀釋（1∶50）的小鼠抗SOD單抗，4℃孵育1 h；用細(xì)胞透化和洗滌液洗滌2次，加入50μL用細(xì)胞透化和洗滌液稀釋（1∶50）的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，4℃避光孵育30 min，用細(xì)胞透化和洗滌液洗滌2次，PBS重懸，用流式細(xì)胞儀收集3×104細(xì)胞分析FITC熒光強(qiáng)度。

1.5 蛋白印跡分析

藥物處理完畢，棄凈細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，每孔加入100μL RIPA細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，吸出所有液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，冰浴30 min，超聲波處理10 s，4℃、20 000 r/min離心20 min，上清即為制備好的細(xì)胞裂解液。取40μL細(xì)胞裂解液與10 μL 5×SDS-PAGE樣品處理液充分混勻，15%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE（80 V，15 min；180 V，50 min），每泳道上樣體積為20μL。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為恒流100 mA，時(shí)間為3 h。電轉(zhuǎn)完畢，用含0.05%吐溫的Tris緩沖鹽溶液（TBST）洗膜，再用封閉液（TBST-5%脫脂奶粉）室溫封閉1 h，加入用封閉液按1∶1000稀釋的小鼠抗SOD單抗，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次5 min；加入用封閉液按1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，每次5 min；將含蛋白的膜面朝上，均勻加上混合好的ECL Plus發(fā)光底物，1 min后棄凈所有液體，用保鮮膜包好PVDF膜，蛋白面朝上，于暗室進(jìn)行曝光、顯影和定影。

1.6 激光共聚焦分析細(xì)胞定位

藥物處理前，將細(xì)胞預(yù)先接種于共聚焦顯微鏡專用平皿中，藥物處理過(guò)程同前。藥物處理完畢，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入100μL 5 μg/mL Alexa Fluor 594標(biāo)記的小麥胚芽凝集素，室溫避光孵育15 min；用預(yù)冷的PBS洗滌3次，用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS室溫固定10 min；PBS洗滌3次，用PBS-0.25%曲拉通通透細(xì)胞10 min；PBS洗滌3次，每次5 min；用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS室溫避光封閉細(xì)胞1 h；加入100μL 1∶50稀釋的小鼠抗SOD單克隆抗體，室溫避光孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min；加入100μL 1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，室溫避光孵育1 h；PBS洗滌3次，每次5 min；加入100μL 1μg/mL的DAPI復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光孵育10 min；PBS洗滌后加入PBS，共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布。

2 結(jié)果

2.1 磷脂化修飾可增強(qiáng)SOD與HCAEC的結(jié)合，并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部

將PC-SOD與HCAEC孵育，并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，制備全細(xì)胞裂解液。蛋白印跡結(jié)果顯示，隨著PC-SOD與細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，全細(xì)胞裂解液中目的蛋白的含量不斷增加（圖1）。

為了更準(zhǔn)確地分析SOD與細(xì)胞的親和性，我們選擇流式細(xì)胞術(shù)對(duì)結(jié)合到細(xì)胞的PC-SOD進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，PC-SOD與細(xì)胞孵育30 min，即可與約72.95%的HCAEC結(jié)合，細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于SOD與HCAEC孵育2 h時(shí)。隨著PC-SOD與細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)合PC-SOD的細(xì)胞更多，孵育3 h后，90%以上的細(xì)胞都結(jié)合了PC-SOD，細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度也不斷增加，結(jié)果見圖2。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磷脂化修飾可顯著增強(qiáng)PC-SOD對(duì)HCAEC的親和力，但蛋白印跡分析和流式細(xì)胞術(shù)都只能檢測(cè)結(jié)合到細(xì)胞上的SOD含量，不能區(qū)分SOD是結(jié)合在細(xì)胞膜上還是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而只有進(jìn)入細(xì)胞，SOD才能發(fā)揮其清除在線粒體上大量產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的生理功能。因此，我們進(jìn)一步選擇激光共聚焦顯微鏡對(duì)藥物孵育后的細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示PCSOD可進(jìn)入細(xì)胞，并呈點(diǎn)樣分布（圖3）。而未經(jīng)修飾的SOD與細(xì)胞作用2 h也很難結(jié)合到細(xì)胞膜上，更不能進(jìn)入細(xì)胞。

3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明磷脂化修飾可增強(qiáng)PCSOD的細(xì)胞親和力，促進(jìn)PC-SOD結(jié)合到細(xì)胞膜上，并進(jìn)入HCAEC內(nèi)部發(fā)揮作用。

2.2 磷脂化修飾可增強(qiáng)SOD與HCM的結(jié)合，并促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部

將PC-SOD與HCM孵育，并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，制備全細(xì)胞裂解液。蛋白印跡結(jié)果顯示，隨著PC-SOD與細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，全細(xì)胞裂解液中目的蛋白的含量不斷增加（圖4）。

圖1 蛋白印跡檢測(cè)PC-SOD與HCAEC的結(jié)合

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC-SOD與HCAEC的結(jié)合

圖3 激光共聚焦顯微鏡分析SOD在HCAEC中的分布

為了更準(zhǔn)確地分析SOD與HCM的親和性，我們選擇流式細(xì)胞術(shù)對(duì)結(jié)合到細(xì)胞上的PC-SOD進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，未修飾的SOD與HCM孵育2 h后，熒光強(qiáng)度與對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有差別，說(shuō)明沒(méi)有修飾的SOD很難結(jié)合到細(xì)胞上；而PC-SOD與細(xì)胞孵育30 min后，約60.57%的HCM顯示有PCSOD結(jié)合，細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度由對(duì)照組的35.38增加到147.5，并且隨著PC-SOD與細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，有熒光的細(xì)胞更多，孵育3 h，結(jié)合有PC-SOD的細(xì)胞約占總細(xì)胞的78.71%，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為194.96（圖5）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磷脂化修飾可顯著增強(qiáng)PC-SOD對(duì)HCM的親和力，但蛋白印跡分析和流式細(xì)胞術(shù)都只能檢測(cè)結(jié)合到細(xì)胞上的PC-SOD，不能區(qū)分PC-SOD是結(jié)合在細(xì)胞膜上還是進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。因此，進(jìn)一步選擇激光共聚集顯微鏡對(duì)藥物孵育后的細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示PC-SOD可進(jìn)入細(xì)胞，并呈點(diǎn)樣分布（圖6）。而未經(jīng)修飾的SOD與細(xì)胞作用2 h也很難結(jié)合到細(xì)胞膜上，更不能進(jìn)入細(xì)胞。

圖4 蛋白印跡檢測(cè)PC-SOD與HCM的結(jié)合

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC-SOD與HCM的結(jié)合

圖6 激光共聚焦顯微鏡分析SOD在HCM中的分布

3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明磷脂化修飾可增強(qiáng)PCSOD的細(xì)胞親和力，促進(jìn)PC-SOD結(jié)合到細(xì)胞膜上，并進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。

3 討論

臨床上采用的心臟外科體外循環(huán)等治療方法，可使組織器官缺血后重新得到血液再灌注，但心肌缺血再灌注時(shí)炎性細(xì)胞和損傷的線粒體等會(huì)產(chǎn)生大量超氧自由基，這些超氧自由基如果不能被盡快歧化清除至正常生理濃度，就會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白氧化和DNA損傷[13]。如何及時(shí)清除這些超氧自由基，對(duì)于減少缺血再灌注損傷具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)Cu/Zn-SOD在清除超氧自由基引起的缺血再灌注損傷中具有較好的臨床應(yīng)用前景[14]。但SOD分子較低的細(xì)胞膜親和性和較短的消除半衰期，使其在臨床試驗(yàn)中結(jié)果不理想。因此，對(duì)SOD進(jìn)行修飾，以提高其細(xì)胞親和性和延長(zhǎng)半衰期，對(duì)于增強(qiáng)SOD在臨床中的應(yīng)用具有重要作用。本研究涉及的PC-SOD是磷脂化的重組人Cu/Zn-SOD，即在每個(gè)SOD二聚體分子上平均結(jié)合4分子的磷脂酰膽堿衍生物，是北京泰德制藥股份有限公司研制的一種新型特異性修飾化的SOD[11]。采用培養(yǎng)的體外細(xì)胞試驗(yàn)表明，修飾后的SOD分子細(xì)胞親和力增加，而其活性僅受到很小的影響[11-12]，在家兔體內(nèi)的試驗(yàn)顯示PC-SOD在血漿中非常穩(wěn)定[11]。

心肌缺血再灌注損傷的病理改變包括心肌細(xì)胞水腫、超微結(jié)構(gòu)改變和微血管受損等。心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞是受影響比較大的2類細(xì)胞，因此本研究選擇了人心肌細(xì)胞和人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討修飾的PC-SOD與這2種細(xì)胞的結(jié)合情況及其進(jìn)入細(xì)胞的能力。研究結(jié)果表明，SOD經(jīng)磷脂化修飾后，與人心肌細(xì)胞和人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合能力大大增強(qiáng)，并能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，而未經(jīng)修飾的SOD很難進(jìn)入這2種細(xì)胞內(nèi)。我們還檢測(cè)了PC-SOD與中性粒細(xì)胞的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)其顯著高于未修飾的SOD分子的結(jié)合能力（結(jié)果未顯示）。

本研究綜合利用了Western印跡、流式細(xì)胞術(shù)和熒光共聚焦顯微術(shù)，分別研究PC-SOD與HCM和HCAEC的結(jié)合能力。結(jié)果表明磷脂化修飾可顯著增強(qiáng)SOD與HCM和HCAEC的親和力，并可顯著增強(qiáng)SOD進(jìn)入HCM和HCAEC的能力。