任華峰，姜天翔，成玉，張曉青，馬曉蕾，曹軍瑞

自然資源部 天津海水淡化與綜合利用研究所，天津300192

高效油污降解菌及其生物乳化劑在油污分離、去除等領(lǐng)域具有十分廣闊的前景，國(guó)內(nèi)外在這一領(lǐng)域的研究十分活躍[1-5]。而低溫油污廢水的生物處理一直存在著微生物活性低、生化處理效果差等問(wèn)題。低溫污水是指溫度在20℃以下、特別是8～15℃之間的污水或廢水。對(duì)于好氧石油降解菌來(lái)說(shuō)，最佳石油降解溫度一般為25～35℃，低于15℃時(shí)，其生長(zhǎng)、繁殖和代謝會(huì)受到影響，從而造成對(duì)石油的降解速率變慢[6-8]。對(duì)此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了初步研究，從石油污染的海洋、土壤中篩選出多種耐低溫石油降解菌[9-13]。我國(guó)北方沿海港口水體污染嚴(yán)重，大多數(shù)污染是由油料泄露、傾倒廢油、排放油污的艙底水、清洗發(fā)動(dòng)機(jī)和船甲板機(jī)械上的潤(rùn)滑油所造成；并且一年中有近6個(gè)月處于低溫區(qū)，海水溫度多在15℃以下。因此，分離高效耐鹽耐冷油污降解菌并應(yīng)用于低溫油污海水的生物修復(fù)治理，將為我國(guó)北方海港低溫油污海水的有效處理提供技術(shù)支持和解決方案，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

我們從天津大港油田海岸潮汐帶底泥中分離到一株耐低溫石油降解菌DSY171，對(duì)其進(jìn)行了鑒定，研究了該菌株的生長(zhǎng)和降解特性，并初步探討了該菌株的碳源利用廣譜性，以期為耐低溫石油降解菌DSY171在低溫油污海水處理中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種富集、分離純化和培養(yǎng)基組成

試驗(yàn)樣品取自天津大港油田海岸潮汐帶底泥。污泥樣品按10%的接入量接種于培養(yǎng)基中，于10℃、160 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)15 d左右，培養(yǎng)基變渾濁后，再按1%的接入量轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d左右，如此重復(fù)3～5次。然后在LB平板上劃線分離，選擇不同形態(tài)特征的菌落，重新轉(zhuǎn)接至加2 g/L原油的MSB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)以驗(yàn)證是否具有原油降解能力，培養(yǎng)液變混后，進(jìn)一步純化，并檢測(cè)發(fā)酵液表面張力，直至得到有降解能力的純培養(yǎng)菌株。

試驗(yàn)用原油取自大港油田，柴油為市售0號(hào)柴油，食用油為市售大豆油，機(jī)油取自天津某機(jī)械廠。

MSB培養(yǎng)基：大港油田原油2 g，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31 g，酵母粉0.01 g，pH7.5，dH2O 1000 mL，如配制固體培養(yǎng)基則加入1.5%的瓊脂。121℃滅菌30 min，用于菌株富集培養(yǎng)和特性試驗(yàn)。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1 g，瓊脂1.5～2 g，pH7.0，蒸餾水100 mL。121℃滅菌30 min，用于菌株保存和培養(yǎng)。

1.2 細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定和生理生化指標(biāo)測(cè)定

細(xì)菌生長(zhǎng)以波長(zhǎng)600 nm處的濁度D600nm表示。革蘭染色、碳源利用等指標(biāo)測(cè)定參照文獻(xiàn)方法[14]進(jìn)行。

1.3 16SrDNA PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

由國(guó)家海洋局第三海洋研究所菌種保藏管理中心完成。

1.4 原油降解率的測(cè)定[15]

將活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株DSY171LB懸液2 mL接入100 mL含0.2%原油的MSB培養(yǎng)液中，以不接菌種的100 mL含0.2%原油的MSB培養(yǎng)液作為對(duì)照，于10℃、160 r/min恒溫振蕩搖床分別培養(yǎng)7和10 d，采用紫外分光光度法測(cè)定。

1.5 原油降解試驗(yàn)的GC-MS分析

色譜條件：色譜柱為DB-5，MS進(jìn)樣口溫度300℃，進(jìn)樣量1μL，進(jìn)樣方式為無(wú)分流進(jìn)樣，柱流量1 mL/min，載氣為He。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊源（election im?pact，EI），電子能量70 eV，離子源溫度200℃，傳輸線溫度300℃，掃描方式為全掃描，掃描速率500 amu/s，掃描范圍50～500 amu。烷烴的溫度程序：初始70℃，保持5 min，然后以4℃/min的速率升至220℃，再以2℃/min的速率升至320℃，保持15 min。

1.6 發(fā)酵液表面張力測(cè)定

原油降解菌一般會(huì)代謝產(chǎn)生乳化劑一類(lèi)的生物活性物質(zhì)，以降低發(fā)酵液的表面張力，增強(qiáng)對(duì)原油的降解代謝能力。因此，檢測(cè)發(fā)酵液的表面張力變化可以間接反映原油降解菌的代謝活性和原油的乳化、降解情況。本試驗(yàn)中發(fā)酵液表面張力測(cè)定采用山東淄博科森公司的Auto-tensi?ometer ZL-2型表面張力測(cè)定儀。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的富集培養(yǎng)及菌種分離純化

經(jīng)過(guò)6次富集馴化培養(yǎng)后，得到混合微生物培養(yǎng)液，它可以在含有2 g/L原油的MSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中混合培養(yǎng)液的D600nm值不斷增加，說(shuō)明該混合液培養(yǎng)物能利用原油生長(zhǎng)。

將上述混合培養(yǎng)物在LB平板上劃線分離，挑取單菌落，經(jīng)過(guò)復(fù)篩、純化后得到一株能以原油為碳源、能源生長(zhǎng)的細(xì)菌菌株，編號(hào)為DSY171（圖1）。菌株DSY171為革蘭陽(yáng)性長(zhǎng)桿狀細(xì)胞，大小為0.4μm×6μm，無(wú)鞭毛，不產(chǎn)芽孢。在LB平板上培養(yǎng)7 d，菌落大小約1 mm，圓形，表面光澤，邊緣整齊，凸出，乳白色。生理生化特征試驗(yàn)表明，菌株DSY171氧化酶為陰性，接觸酶為陽(yáng)性；硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原陰性；DNA的G+C含量為62.3%，與紅球菌屬（Rhodococcussp.）的特征基本一致。擴(kuò)增菌株DSY171的16S rRNA部分基因，長(zhǎng)度為1387 bp，與同源性較高的模式菌株進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)DSY171與R.degradans在同一分支上。結(jié)合生理生化及分子鑒定結(jié)果，初步確定菌株DSY171歸屬紅球菌屬。

2.2 菌株DSY171利用原油的生長(zhǎng)和對(duì)原油的降解

圖1 菌株DSY171的透射電鏡照片

將DSY171菌株接種于含2 g/L原油的MSB培養(yǎng)基中，12℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定菌體生長(zhǎng)和原油降解情況，結(jié)果見(jiàn)圖2，DSY171菌株對(duì)石油的降解能力基本同步于菌體的生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)曲線遲緩期基本在0～4 d，這期間是原油對(duì)菌體相關(guān)降解酶進(jìn)行誘導(dǎo)的時(shí)期，菌體生長(zhǎng)和石油降解均不顯著；隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)期（4～7 d），約7 d達(dá)到最高菌體生長(zhǎng)量，石油降解率同時(shí)也快速上升，達(dá)到30%以上；7～11 d進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體的生長(zhǎng)變化不大，9～11 d時(shí)降解率達(dá)到50%～60%。與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)研究報(bào)道相比，也是一株非常高效的耐低溫石油降解菌[8-10,13]。

2.3 菌株DSY171生長(zhǎng)和降解原油的最佳條件

2.3.1 最適溫度溫度是微生物生存繁殖的重要影響因子，較低溫度下微生物新陳代謝處于受抑制狀態(tài)。按1%的接種量（菌液D600nm=1.2）將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌株DSY171接種于石油質(zhì)量濃度為2 g/L的MSB培養(yǎng)基中，在pH7.5、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，分別考察菌株DSY171在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃的適應(yīng)性。圖3為培養(yǎng)12 d的菌株DSY171生長(zhǎng)和原油降解情況。菌株DSY171在低溫條件下（10℃～15℃）12 d的石油降解率顯著優(yōu)于常溫條件（20℃～30℃），低溫條件下原油的降解率為60%左右，中高溫條件下原油的降解率為10%左右。但低溫條件下菌株的生長(zhǎng)和代謝比較緩慢。

圖2 菌株DSY171的生長(zhǎng)和石油降解

圖3 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)和原油降解率的影響

2.3.2 最適初始pH值按1%的接種量（菌液D600nm=1.2）將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的菌株DSY171接種于石油質(zhì)量濃度為2 g/L的MSB培養(yǎng)基中，在12℃、160 r/min條件下，進(jìn)行pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的最適初始pH試驗(yàn)。經(jīng)過(guò)12 d的培養(yǎng)，初步結(jié)果表明菌株DSY171的pH適應(yīng)范圍較廣，在初始pH值為6～9的范圍內(nèi)均能代謝生長(zhǎng)，但在偏堿性環(huán)境下（pH7～9）的代謝生長(zhǎng)好于偏酸性環(huán)境（pH6～7）（圖4）。

2.4 菌株DSY171碳源利用試驗(yàn)

菌株DSY171在降解原油的同時(shí)，可以產(chǎn)生乳化劑等活性物質(zhì)，以降低發(fā)酵液的表面張力，乳化分散原油，加快代謝利用。為了檢驗(yàn)DSY171菌株的底物利用范圍，以柴油、食用油、機(jī)油和正十六烷為底物，代替原油配制MSB培養(yǎng)基，碳源填加量為0.3%（v/v），接種DSY171菌株，最適條件下培養(yǎng)12 d，測(cè)定菌體生長(zhǎng)（D600nm）及其培養(yǎng)液表面張力，結(jié)果見(jiàn)圖5。菌株在以柴油為底物的MSB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最好，并產(chǎn)生乳化劑，培養(yǎng)液表面張力下降到40 mN/m以下；此外，菌株DSY171對(duì)食用油、機(jī)油和正十六烷也均有一定的降解能力。

圖4 pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)和原油降解率的影響

2.5 原油降解試驗(yàn)的GC-MS檢測(cè)分析

為了進(jìn)一步研究菌株DSY171對(duì)原油烴中各組分的降解情況，進(jìn)行了GC-MS檢測(cè)分析。在原油含量為0.2%的MSB培養(yǎng)基中，菌株DSY171在10℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)12 d，將MSB培養(yǎng)液中的原油用正己烷萃取進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。與對(duì)照相比，菌株DSY171對(duì)原油烴各組分的降解效果非常顯著，大部分烴組分甚至被完全降解，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，菌株DSY171對(duì)原油中中長(zhǎng)鏈烷烴具有良好的降解能力。

綜上，耐低溫石油降解菌DSY171的分離及其降解特性的研究，為生物學(xué)方法解決低溫環(huán)境石油污染問(wèn)題提供了高效菌種，在環(huán)境微生物學(xué)理論研究和實(shí)踐應(yīng)用中具有一定的意義和價(jià)值。后續(xù)，將對(duì)其生物乳化劑的組成和結(jié)構(gòu)，以及處理模擬低溫油污海水進(jìn)行深入研究。

圖5 菌株DSY171對(duì)柴油等不同碳源的利用

圖6 DSY171降解樣品中原油烴組分的GC-MS譜圖