李艷青，齊婷娟，郭婷婷，李霄，周玉柏

北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124

食管癌是世界第七大癌癥，在常見癌癥死亡原因中位列第六位，2018年新發(fā)病例約57萬，死亡病例約50萬[1]。食管癌的標(biāo)準(zhǔn)治療為手術(shù)切除并輔以放化療。然而，由于食管癌早期癥狀不明顯以及腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移活性較強，患者就診時大多已處于疾病的晚期，因此預(yù)后較差，綜合5年生存率不超過20%[2]。

樺褐孔菌［Inonotus obliquus（Fr.）Pilat］是擔(dān)子菌亞門、多孔菌科、纖孔菌屬真菌，又稱樺樹茸、白樺茸，是生長在白樺樹上的大型藥用真菌，菌核直徑7～36 cm，形似肉瘤狀平伏在樹皮下，呈黃褐色至黑色，有明顯凹凸不平開裂的小塊，主要分布于俄羅斯西伯利亞、遠(yuǎn)東地區(qū)，日本北海道，以及我國黑龍江和吉林長白山地區(qū)[3]。樺褐孔菌的主要藥理作用包括抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、降低弓形蟲感染等，且細(xì)胞毒性低，無明顯副作用[4]。我們研究了樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對食管癌細(xì)胞株EC-109和EC-9706的增殖、克隆形成能力、凋亡及細(xì)胞周期等方面的影響，初步揭示了樺褐孔菌對食管癌細(xì)胞株的作用機理，為樺褐孔菌抗食管癌的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌藥材購自吉林省白山市；食管癌細(xì)胞株EC-109和EC-9706購自ATCC；DMSO、AnnexinVFITC/PI凋亡檢測試劑盒、DNA含量檢測試劑盒購自Solarbio公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；中草藥粉碎機購自天津市泰斯特儀器有限公司；Rotavapor R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自Buchi公司；NovoCyte3130細(xì)胞流式儀購自艾森生物公司；全波長酶標(biāo)儀購自Perkin Elmer公司；KD-300DE型數(shù)控超聲波清洗器購自昆山市儀器有限公司。

1.2 樺褐孔菌乙酸乙酯提取物制備

稱取樺褐孔菌粉末100 g，加入95%乙醇1000 mL，回流提取2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑，然后加去離子水至100 mL，用乙酸乙酯萃取3次，每次加入乙酸乙酯約100 mL，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯提取物5.52 g。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

食管癌細(xì)胞株EC-109、EC-9706用含10%胎牛血清（FBS）和100μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT法細(xì)胞增殖實驗

將對數(shù)生長期的EC-109、EC-9706細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，將樺褐孔菌乙酸乙酯提取物以12.5、25、50、100、200μg/mL的濃度設(shè)置5個梯度，每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔加入100μL不同濃度的乙酸乙酯提取物，同時設(shè)置空白和對照組；培養(yǎng)48 h后，各板加入20μL/孔MTT，37℃孵育4 h，棄舊培養(yǎng)基，加150μL DMSO，用酶標(biāo)儀測定D490nm值。

1.5 平板克隆形成實驗

將EC-109、EC-9706細(xì)胞按200/孔接種于6孔板，加入相應(yīng)劑量的乙酸乙酯提取物，每3 d更換含乙酸乙酯提取物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 d。PBS洗2次，0.1%結(jié)晶紫甲醇溶液固定染色25 min，進(jìn)行細(xì)胞克隆計數(shù)。

1.6 細(xì)胞凋亡實驗

將1×104/孔EC-109、EC-9706細(xì)胞接種6孔板，24 h后加入相應(yīng)劑量的乙酸乙酯提取物；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗2次，用1 mL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100μL細(xì)胞懸液，加入5μL AnnexinV-FITC，室溫避光孵育10 min；加入5μL PI溶液，室溫避光孵育5 min；加入PBS至500μL，輕輕混勻，過300目尼龍篩網(wǎng)，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.7 細(xì)胞周期實驗

實驗分組及細(xì)胞處理與細(xì)胞凋亡實驗相同，加入乙酸乙酯提取物并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗1次，在細(xì)胞中加入500μL預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定12 h，離心去上清，PBS洗2次；加入100μL RNaseA溶液，37℃水浴30 min；加入400μL PI染色液，4℃避光孵育30 min；過300目尼龍篩網(wǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與做圖，數(shù)據(jù)用x±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組之間用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT細(xì)胞增殖實驗

與對照組相比，乙酸乙酯提取物可顯著抑制食管癌細(xì)胞EC-109和EC-9706的增殖，且隨著乙酸乙酯提取物濃度的增加，細(xì)胞抑制率也明顯增加（圖1，P＜0.05）。

2.2 平板克隆形成實驗

乙酸乙酯提取物在不同濃度下對EC-109和EC-9706細(xì)胞的克隆形成均表現(xiàn)出抑制作用，且抑制率呈濃度依賴關(guān)系，與對照組相比具有顯著性差異（圖2，***P＜0.001）。

2.3 細(xì)胞凋亡實驗

將食管癌細(xì)胞株EC-109和EC-9706分別用樺褐孔菌乙酸乙酯提取物處理后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果如圖3、4。與陰性對照組相比，乙酸乙酯提取物處理后的細(xì)胞凋亡率明顯增加，表明樺褐孔菌乙酸乙酯提取物促進(jìn)了EC-109（P＜0.001）和EC-9706（P＜0.001）細(xì)胞株的凋亡。

圖1 乙酸乙酯提取物對食管癌細(xì)胞生長的抑制率（x±s，n=5）

2.4 細(xì)胞周期實驗結(jié)果

用樺褐孔菌乙酸乙酯提取物處理食管癌細(xì)胞株EC-109和EC-9706后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。如圖5所示，在EC-109細(xì)胞中，相較于對照組，乙酸乙酯提取物組細(xì)胞被阻滯在G1期的細(xì)胞顯著增加（P＜0.001）；如圖6所示，在EC-9706細(xì)胞中，相較于對照組，停留在G1期的細(xì)胞顯著增加（P＜0.001）。實驗結(jié)果表明樺褐孔菌的乙酸乙酯提取物影響了食管癌細(xì)胞株EC-109、EC-9706的周期進(jìn)程，從而對細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響。

3 討論

圖2 樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對食管癌細(xì)胞克隆形成能力的影響

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測乙酸乙酯提取物對食管癌細(xì)胞EC-109凋亡的影響

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測乙酸乙酯提取物對食管癌細(xì)胞EC-9706凋亡的影響

圖5 樺褐孔菌提取物對食管癌細(xì)胞EC-109細(xì)胞周期的影響

圖6 樺褐孔菌提取物對食管癌細(xì)胞EC-9706細(xì)胞周期的影響

樺褐孔菌對多種腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用[5-9]，但其具體抗腫瘤作用機制卻不甚清楚。現(xiàn)代研究表明，樺褐孔菌含有215種化學(xué)成分，其中已報道的具有生物活性的主要有多糖、羊毛甾醇型三萜類、樺褐孔菌醇、樺褐孔菌素、黑色素類和木質(zhì)素類等成分[10-15]。在眾多化學(xué)成分中，樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌的主要化學(xué)成分，同時也是其主要的活性成分。樺褐孔菌多糖構(gòu)成比較復(fù)雜，常見的主要成分有雜多糖、β葡聚糖以及它們的蛋白質(zhì)復(fù)合物等[16-17]，目前對其化學(xué)成分和藥理作用的研究較多。然而，樺褐孔菌乙酸乙酯提取物的抗腫瘤活性及機理研究并不充分。

本研究選擇食管癌細(xì)胞為研究對象，重點探討樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對腫瘤細(xì)胞的作用及其內(nèi)在機理。首先，在細(xì)胞水平上采用經(jīng)典的MTT法檢測樺褐孔菌乙酸乙酯提取物對食管癌細(xì)胞EC-109和EC-9706增殖的影響，結(jié)果顯示乙酸乙酯提取物可顯著抑制食管癌腫瘤細(xì)胞的增殖，平板克隆實驗也進(jìn)一步確證乙酸乙酯提取物可抑制食管癌細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)乙酸乙酯提取物處理的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯在G1期，且細(xì)胞調(diào)亡的比率顯著高于對照組。上述結(jié)果提示，乙酸乙酯提取物通過影響腫瘤細(xì)胞周期及凋亡通路來抑制食管癌細(xì)胞的增殖，發(fā)揮其抗腫瘤的活性，但其確切的作用靶點還有待后續(xù)研究進(jìn)一步確定。

綜上，本研究結(jié)果表明樺褐孔菌乙酸乙酯提取物能有效抑制食管癌細(xì)胞EC-109和EC-9706的增殖，并且能夠減弱細(xì)胞克隆形成能力，且樺褐孔菌乙酸乙酯提取物潛在的作用靶點可能位于細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡通路中。樺褐孔菌乙酸乙酯提取物具有一定的抗食管癌活性。