張樹山，韓雪峻，姜紅菊，戴建軍，吳彩鳳，孫玲偉，張德福＊

（1.上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海市農業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3.上海祥欣畜禽有限公司/上海種豬工程技術研究中心， 上海 201302）

優(yōu)秀種公豬是豬育種和生豬商品化生產中最重要影響因素之一。2009 年起，全國性的豬遺傳改良計劃開始全面實施，標志著我國豬育種已開始與國際接軌。近十年來，在國家生豬良種補貼項目與國家生豬核心育種場建設等一系列措施的推動下，建設大量布局合理的以提供精液（液態(tài)保存或冷凍精液）為主的種公豬站，已明顯改變了國內育種單位間遺傳物質的交流及豬場的引種模式，眾多養(yǎng)豬企業(yè)理性地根據自身育種和生產需求引進、訂制種豬精液已成為當前的主流，在節(jié)省引種成本和提高豬場生物安全性等方面均有重大意義。

作為一個系統(tǒng)工程，豬人工授精技術體系主要包括種公豬精液采集、稀釋、保存（液態(tài)和冷凍保存）和人工輸精等多個重要環(huán)節(jié)，每一個環(huán)節(jié)執(zhí)行效果均對后續(xù)環(huán)節(jié)及最終人工輸精效果產生重要影響。

1 種公豬精液采集環(huán)節(jié)

傳統(tǒng)的手握法是過去和目前仍在使用的公豬精液采集方法。該方法有成本低、對設備要求低等優(yōu)點，但采精員勞動強度大、效率較低，且精液與空氣充分接觸容易遭受源自環(huán)境和公豬體表的污染，但此方法目前仍在部分中小規(guī)模的豬場和農戶中廣泛使用。

公豬自動采精系統(tǒng)。是采精人員在地坑式通道，一側或兩側的隔欄內安裝多套自動采精設備，通過與豬舍連接的可變柵欄通道將公豬驅趕至公豬自動采精架前。假臺豬下方的滑軌上分別裝配有一個用于固定精液收集杯的支架和一個固定假陰道的夾具。采集人員帶手套握持固定假陰道，刺激公豬至其陰莖勃起、射精，待棄去第一段射出精液后，將精液收集杯固定在配備的夾具上，并與假陰道連接。假陰道能保持適宜溫度和刺激壓力，使公豬陰莖持續(xù)正常射精。射精結束后，采精人員撕去精液收集袋上端部分（即過濾袋），打結扎緊精液收集袋后移至保溫裝置中，運抵精液處理室。目前，公豬自動采精系統(tǒng)已開始在一些大、中型豬場和種公豬站廣泛應用，此方法不僅能大幅度減少精液中細菌數量，還能改善采精員的工作環(huán)境并提高其工作效率，且能降低人為因素影響。

2 種公豬精液保存環(huán)節(jié)

目前豬精液保存方法主要有液態(tài)保存和冷凍保存。其中液態(tài)保存精液分為常溫（15 ～17 ℃）和低溫保存（4 ～5 ℃）兩種，即精液采集后與稀釋液以一定比例作等溫稀釋，然后緩慢降溫至特定溫度區(qū)間并保持恒溫，液態(tài)精液使用受時間和空間限制。與液態(tài)精液保存相比，豬精液冷凍保存操作相對較復雜、費時，需要等溫稀釋、15 ～17 ℃條件下降溫平衡、離心濃縮和添加含有甘油、OEP 等冷凍保護成分的稀釋液，經裝管（主要有0.5、3.0 和5 mL 等劑型）、封口、打印標記和冷凍降溫等操作，最后移至液氮中長期保存，理論上可突破時間和空間限制。

圖1 法國卡蘇公司生產的公豬自動采精系統(tǒng)

2.1 豬精液液態(tài)保存研究和應用概況

豬人工授精技術在1932 年首次試驗成功，從20 世紀50 年代開始在世界各地廣泛應用，因此便產生了豬液態(tài)精液保存的需求[1]。研究者們經過大量試驗發(fā)現，精液保存溫度高于18 ℃時，精子運動性能較強會造成其能量過度消耗，從而明顯降低精子的活率（活精子百分率）；溫度低于15 ℃時，精子容易遭受“低溫打擊”導致不可逆損傷；而將精液等溫稀釋后室溫靜置（22 ～26 ℃）1 h 后置于17 ℃條件下，保存效果遠優(yōu)于其他溫度。隨后豬常溫精液開始普遍應用，種公豬站一般將稀釋過的精液置于恒溫箱（15 ～17 ℃，或在泡沫盒加包裹嚴實的冰袋）在1 ～2 d 內快遞至客戶，包裝要密封性好、尤其要考慮降低碰撞和劇烈震蕩對精液的影響，其有效利用期一般不超過5 d。除適宜的保存溫度外，研發(fā)安全、有效并成本適宜的稀釋液，是提高豬常溫精液保存效果的主要途徑。過去的幾十年里，稀釋液研發(fā)主要基于以下幾方面：1）緩沖成分，使精液在保存過程中pH 酸堿度和滲透壓不發(fā)生大幅度變化；2）適宜的糖類可能為精子提供能量、維持精子細胞內外溶液滲透壓平衡；3）低毒的抗氧化物質，抑制活性氧（ROS）對精子質膜和頂體中的脂質氧化損傷；4）新型抗生素或抗菌肽等，最大程度抑制精液中細菌的繁殖?？ㄌK（iMV）、迷尼圖（Minitube）和國內一些公司已開發(fā)出眾多的中效、長效和超長效稀釋粉產品，用戶可以根據使用時間確定采用哪種稀釋粉。

豬精液低溫保存，一般指添加含有抗低溫打擊成分的稀釋液、降溫平衡至4 ～5 ℃條件下保存。與常溫保存相比，低溫條件下精子能保持更低的基礎代謝水平和運動性能，能大幅度地延長豬液態(tài)精液使用的有效期，恒溫和運輸成本與常溫精液相當；與冷凍保存精液相比，低溫保存過程中降溫平衡相對操作簡單、耗時短，不用添加甘油和OEP 等有毒性的冷凍保護劑，且不經歷冷凍-解凍過程中對精子機械性和溶液性損傷，故其精子運動性能和精子頂體完整性等指標遠高于冷凍精子，而與常溫保存相比且其有效使用期限大大延長。普遍認為，低溫保存精液能最大程度地挖掘液態(tài)保存潛力，在提高優(yōu)良種公豬利用率及豬聯合育種方面具有很廣的應用前景。但與豬精液常溫和冷凍保存相比，低溫保存研究和應用報道較少。

豬精液低溫保存使用的稀釋液是在常溫保存稀釋液基礎上增加抗低溫打擊成分。近幾年研究發(fā)現，稀釋液中添加脫脂奶粉對精子的低溫保護效果遠優(yōu)于雞蛋卵黃和全乳，可以將液態(tài)精液的有效使用期增長至2 周[2]。由于脫脂奶粉現有生產工藝具有較好的殺菌效果，故利用市售脫脂奶粉取代雞蛋卵黃或全乳是一個較好選擇。

2.2 豬精液冷凍保存技術研究和應用概況

豬精液冷凍保存技術一般指利用液氮（-196 ℃）作為冷源，經離心濃縮、添加保護成分并經過適當的降溫平衡和冷凍，使精子細胞的代謝幾乎完全停止，從而達到長期保存的目的。普遍認為，豬冷凍精液意義在于：1）使優(yōu)秀種公豬的遺傳資源突破時空限制；2）通過引進冷凍液取代活體引種，能大幅度降低運輸、飼養(yǎng)管理和免疫等成本；3）對供種和引種豬場的生物安全性遠高于液態(tài)保存精液，其價值在過去非洲豬瘟肆虐的一年多已得到體現。

家畜精液冷凍最早在牛上獲得成功，并實現冷凍精液在養(yǎng)牛業(yè)普遍應用。豬精液冷凍技術研究早期，主要參照牛上的方法。然而與牛相比，豬精液量較大、精子對“冷休克”敏感，需要在冷凍前離心除去大部分精漿，且對降溫平衡條件要求較高，導致豬精液冷凍難度遠大于牛。此外，作為多胎性家畜，豬冷凍精液能否應用取決于受胎率和窩產仔數2 個指標（而牛冷凍精液僅涉及受胎率）能否被用戶接受，上述兩方面因素制約了豬精液冷凍保存技術研究和應用。

一直到20 世紀70 年代，Polge等[3]首次利用手術法將冷凍精液直接注入輸卵管成功產下仔豬。由于冷凍細管較適于自動化、標準化生產，且不容易遭受污染、容易標記，故冷凍細管很快就取代顆粒、安瓿瓶等劑型成為家畜冷凍精液的標準劑型。1975 年，豬的顆粒和細管冷凍精液開始在豬育種中得到應用，但到21 世紀初使用冷凍精液的母豬數量還不到授精總量的1%[1]。迄今為止，國際上已經召開了八次關于豬精液冷凍保存的大型國際會議，全世界研究者們在保存方法、精液冷凍處理程序等方面作了大量的交流工作，對豬精液冷凍保存技術的發(fā)展和應用起到了積極的推動作用。我國豬精液冷凍保存技術研究略晚于國外。從20 世紀60 ～80 年代，我國在多個省市曾經大規(guī)模展開豬冷凍精液輸精試驗，如廣西畜禽品種改良站試驗的情期受胎率和平均窩產仔數分別為75.97%和9.42頭[4]。豬冷凍精液品質較差、解凍操作相對復雜，使用常規(guī)輸精方法效果遠低于液態(tài)保存精液，故過去幾十年豬精液冷凍保存技術一直止步于試驗階段。

圖2 上海祥欣畜禽公司投資建設的豬冷凍精液商業(yè)化生產和研究平臺

近十年來，隨著可精準控制降溫的專用精子冷凍儀的應用，及在配套的母豬發(fā)情鑒定和深部位輸精等技術的推動下，研究者們終于探索出一套針對豬精液和精子特性的濃縮、降溫平衡和解凍工藝，表明豬冷凍精液已具備商業(yè)化生產條件。自2009 年起，在國家生豬良種補貼項目與國家生豬核心育種場建設等的推動下，開始建設大量以提供精液（液態(tài)保存或冷凍精液）為主的種公豬站，從而改變了國內豬場的引種模式，眾多養(yǎng)豬企業(yè)理性地根據自身育種和生產需求引進、訂制種豬精液已成為當前的主流。在目前非洲豬瘟形勢仍不樂觀的大背景下，豬冷凍精液開始受到豬育種和生產企業(yè)重視和青睞，極大地推動了其商業(yè)化生產和應用進程，部分育種企業(yè)下屬種公豬站的冷凍精液已處于供不應求狀態(tài)。

家畜精液冷凍保存技術的另一個用途是遺傳資源保護（即“精子庫”），主要用于我國地方豬遺傳資源的保護。2019 年6 月起，為有效應對非洲豬瘟疫情對地方豬遺傳資源的威脅，我國全面啟動了國家級地方豬遺傳材料采集保存工作，全面采集地方豬精液并以冷凍精液的形式收入國家級家畜基因庫長期保存。

2.3 豬精液保存過程中的細菌控制

保存精液中的細菌數量由原精液、稀釋液、保存時間和溫度等因素決定[5,6]。已證實，豬精液中含有50 多種細菌微生物，如大腸桿菌、變形桿菌、沙雷菌、腸桿菌、克雷伯菌、葡萄球菌、鏈球菌和假單胞菌等[7]。而精液稀釋液普遍含有豐富的營養(yǎng)物質、適宜的pH 和滲透壓，是適合大多數細菌繁殖的培養(yǎng)液，在沒有抗生素或抗生素失活情況下，細菌數量會以幾何級快速增加。近幾年來，隨著公豬精液自動采集系統(tǒng)、純水制備儀、即用型商品化稀釋粉等新技術手段的逐步廣泛應用，環(huán)境因素導致的細菌數量已大幅度降低。

微生物或病原體污染的液態(tài)（4 ～20 ℃）和冷凍保存精液（-196 ℃）能引起母畜生殖系統(tǒng)疾病，甚至導致整個畜群健康狀況下降。目前，抑制家畜精液中細菌微生物主要通過在稀釋液中添加青、鏈霉素等常規(guī)和一些新型廣譜抗生素。早在20 世紀80 年代就有人提出，考慮到青霉素和鏈霉素的耐藥性，應該禁止在家畜精液保存使用的稀釋液中添加[8]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）早在2013 年就對牛、豬和一些小反芻動物精液保存過程中使用抗生素種類和添加量提出了規(guī)范[9]。最近幾年，人們開始將一些新型廣譜抗生素低濃度結合使用（即“雞尾酒”法）用于降低精液保存過程中的抗生素耐藥性[10]。

近幾年來，一些具有較好抗菌功能且無耐藥性擔憂的植物性多糖和抗菌肽開始受到重視。尤以一類廣泛分布于昆蟲、動植物中的抗菌肽，具有微量抗菌譜廣（包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和寄生蟲）、抗帶包膜病毒的作用，且大多數對正常真核細胞無毒性或低毒性，且?guī)缀鯚o耐藥性，被認為是現有抗生素的最佳替代品?；谪i精液中也存在豐富的具有抑菌功能的抗菌肽，一些研究者通過對其進行生物合成并用于精液保存試驗，取得了較好抑菌效果[11,12]。

3 人工輸精環(huán)節(jié)

在自然交配模式下，1 頭種公豬最多能負擔30 ～50 頭母豬的配種任務，種公豬利用效率極低且易傳播疾病。而人工授精技術可以以最小的有效輸精量，將高倍稀釋和液態(tài)保存精液或小體積的冷凍精液送到母豬子宮頸或子宮內，從而提高種公豬利用效率、突破時空限制并提高養(yǎng)豬業(yè)生物安全性。

3.1 配種母豬的繁殖管理

配種母豬的繁殖管理水平是影響其人工輸精效果的一個重要因素。一個豬場應該建立完善的繁殖記錄制度。有條件的豬場可以應用新型的電子耳標和電子數據庫，使技術員能更加方便、詳細地掌握母豬群的整體和個體的健康和繁殖情況以及存在的問題。

母豬的發(fā)情鑒定。一般由經驗豐富的技術員根據母豬的一些生理表現（如急躁不安、爬跨其他母豬、食欲不好和咬圈欄等，外陰部變紅、發(fā)腫和黏液流出等）、手術結扎公豬試情和壓背試情等方法判定。有研究者嘗試利用B 超觀察母豬卵泡發(fā)育和排卵動態(tài)，然而經產母豬卵泡直徑遠大于初產母豬（發(fā)情時分別為5.23±1.36 mm 和3.42±1.87 mm）[13]。B 超方法不好制定評價標準、設備還需改進且操作相對復雜，故B 超用于母豬發(fā)情鑒定在將來一段時間難以廣泛應用。

對于乏情母豬，首先要結合記錄查明不發(fā)情的母豬是否患有疾病，如營養(yǎng)缺乏和代謝紊亂等；其次從母豬的飼養(yǎng)方式著手，給母豬增加蛋白質和維生素等營養(yǎng)物質攝入量，保證其正常排卵和受精的營養(yǎng)基礎；也可以通過結扎公豬爬跨、精液（或性腺分泌物）涂抹刺激及注射或口服激素、使用商品化母豬誘情劑等方法。

3.2 豬人工輸精方法

豬人工輸精方法分為傳統(tǒng)的子宮頸輸精法和深部位輸精法兩類。傳統(tǒng)的子宮頸輸精法貫穿整個豬人工授精發(fā)展史，隨著發(fā)情鑒定方法日趨完善和商業(yè)化輸精器的問世，液態(tài)保存精液利用該方法可取得與自然交配相當或更高的受胎率和窩產仔數。然而，其缺點是子宮頸與受精部位距離相對較遠，有效輸精量較大（80 mL）造成精液浪費，受季節(jié)和精液品質影響較大。近幾年開始廣泛應用的母豬深部輸精法也叫子宮內授精法，采用專門設計的更長更細套管式輸精器（比普通輸精管長15 ～20 cm），能通過子宮頸皺褶將精液送至子宮內，與常規(guī)輸精方法相比，離受精位置更近一些，從而增加到達受精部位的有效精子數（20 ～40 ml，2×108～10×108），明 顯 提 高 母豬受胎率和窩產仔數[14]。很多年前，一些研究者利用腹腔鏡微創(chuàng)手術法極小劑量精子直接送至子宮角或輸卵管，受胎率幾乎接近或達到100 %，并能直接看到母豬卵泡發(fā)育情況。但腹腔鏡手術法需要昂貴、復雜的儀器，且母豬腹部脂肪層較厚，導致操作難度遠遠高于羊。目前，一方面，商品化深部位輸精器成本的降低和設計日趨合理，提高了使用效果并降低了操作難度；另一方面，育種價值較高、低品質的液態(tài)保存精液與冷凍精液，及夏季高溫期間人工輸精需要采取深部位輸精方法保持可接受的受胎率和窩產仔數。此外，高價值的精液（如性控精液或攜外源基因精子）也可以采取腹腔鏡微創(chuàng)手術法[15]。

然而，也有研究者認為，雖然深部輸精方法取得較高的窩產仔數，但可能導致母豬子宮內胎兒間營養(yǎng)物質競爭更加激烈；且深部輸精方法降低了母豬生殖道對精子的自然篩選強度，使一些品質較差精子有機會與卵子結合。上述兩個因素可能是深部輸精方法容易造成弱仔數增多的原因。盡管如此，深部輸精方法仍不失為一種提高優(yōu)秀種公豬和母豬利用效率的有效途徑。

3.3 豬人工輸精技術應用趨勢

在過去近三十年里，國外研究者將外源生殖激素用于母豬的性周期同步化處理，旨在實現母豬群體達到配種同步化的定時輸精，并能促進母豬發(fā)情和排卵、提高產仔數和年產胎次。研究和實踐發(fā)現，激素處理后對母豬實施定時輸精，可以使管理者更精確地估計對精液的需求量、提高技術人員勞動效率和福利。在人工輸精技術在我國養(yǎng)豬業(yè)普及應用背景下，通過定時輸精技術促進大中型養(yǎng)豬企業(yè)實現母豬繁殖批次化生產管理、充分挖掘母豬生產潛能來提高豬場經濟效益，已成為提高我國養(yǎng)豬業(yè)生產水平的必然措施。目前國內一些母豬定時輸精的試驗研究結果表明，母豬的發(fā)情率、妊娠率以及窩產仔數總體上高于自然發(fā)情豬群。

4 小結

禍兮福所倚。從2018 年開始非洲豬瘟給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來的巨大沖擊的同時，促進了國內豬育種單位、養(yǎng)豬企業(yè)之間的豬遺傳物質交流模式由傳統(tǒng)的活體引種向精液（液態(tài)和冷凍保存）交流轉變，尤其推動了豬冷凍精液實現了商業(yè)化生產和銷售及豬人工授精技術體系新的升級，必將最終推動我國從養(yǎng)豬大國走向養(yǎng)豬強國。