孫華偉，張敬峰＊

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)診斷檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

由于熒光定量PCR（Q-PCR）具有極高的靈敏性[1]，極容易受到污染，所以其對(duì)實(shí)驗(yàn)室的配置和操作人員的要求更為苛刻?，F(xiàn)將Q-PCR 在非洲豬瘟檢測(cè)過程中遇到的常見問題與解決方案和大家分享如下。

1 Q-PCR 的CT 值顯示異常

Q-PCR 是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過CT 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。擴(kuò)增曲線反應(yīng)了Q-PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線；熒光閾值是以前15 個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），一般熒光閾值的默認(rèn)設(shè)置是3 ～15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍；CT 值是PCR 擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，見圖1。

1.1 陽性對(duì)照或陽性樣品不顯示CT值及解決方案

圖1 Q-PCR 擴(kuò)增曲線示意圖

部分檢測(cè)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室人員在進(jìn)行非洲豬瘟樣品檢測(cè)時(shí)，時(shí)常出現(xiàn)陽性對(duì)照有典型的“S”型擴(kuò)增曲線，但不顯示CT 值（CT 值顯示為Undeter）的情況，出現(xiàn)這種情況的主要原因是儀器默認(rèn)的熒光閾值線過高。

解 決 方 案。 把Threshold 的Auto 自動(dòng)取消，設(shè)成手動(dòng)，熒光閾值一般設(shè)在PCR 指數(shù)擴(kuò)增的起始，并高于陰性對(duì)照曲線。其數(shù)值選擇與試劑盒的性能有關(guān)，對(duì)熒光強(qiáng)度較高的擴(kuò)增曲線，閾值的設(shè)定不一定非要遵循固定的原則。因此，針對(duì)試劑盒性能不同，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的閾值范圍，盡可能保證低值樣本檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，見圖2。

1.2 檢測(cè)樣品無典型“S”形擴(kuò)增曲線，但其CT 值顯示為陽性及解決方案

被檢樣品無典型“S”形擴(kuò)增曲線，但其CT 值顯示為陽性（按照試劑盒說明書CT 值判定標(biāo)準(zhǔn)）的情況在實(shí)際檢測(cè)過程中出現(xiàn)的頻率更高，出現(xiàn)這種情況的主要原因大多是由于被檢樣品不夠新鮮或經(jīng)反復(fù)凍融等。

圖2 Q-PCR 閾值線手動(dòng)設(shè)置示意圖

解決方案。經(jīng)過對(duì)部分實(shí)驗(yàn)室的實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)上述情況的實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)試劑盒提供的陰性對(duì)照或無菌無核酸酶水時(shí)，則沒有出現(xiàn)“無典型擴(kuò)增曲線，但CT 值顯示為陽性”的情況，這就說明出現(xiàn)這種情況的主要原因大多是由于被檢樣品不夠新鮮或經(jīng)反復(fù)凍融等，因此被檢樣品要盡量新鮮，4 ～8 ℃保存的血清或抗凝血樣品一般不超過120 h，唾液樣品經(jīng)離心后再進(jìn)行檢測(cè)，凍融次數(shù)一般不超過3 次。

2 實(shí)驗(yàn)過程操作不夠規(guī)范

通過實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)不少檢測(cè)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行熒光PCR 檢測(cè)時(shí)，操作很不規(guī)范，對(duì)于檢測(cè)試劑盒的說明書，只知其然而不知其所以然，在遇到問題時(shí)也不知該如何解決。

2.1 加樣不規(guī)范

1）加入樣品模板及陽性對(duì)照前，未進(jìn)行瞬時(shí)離心，致使開蓋時(shí)，由于蓋上粘有液體而引起氣溶膠污染；

2）進(jìn)行加樣時(shí)使用的移液器吸頭較短，因移液器的污染而導(dǎo)致樣品間的交叉污染，圖3；

3）加樣時(shí)未關(guān)閉生物安全柜里的照明燈；

4）加入核酸模板后未盡快上機(jī)，致使探針淬滅。

2.2 擴(kuò)增后處理不規(guī)范

1）擴(kuò)增后，在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)開啟PCR 反應(yīng)管，導(dǎo)致試驗(yàn)區(qū)域的氣溶膠污染；

2）檢測(cè)過程中用到的吸頭、離心管及PCR 反應(yīng)管未及時(shí)進(jìn)行清理和高壓處理。

2.3 解決方案

1）在打開裝有PCR 試劑的反應(yīng)管、陽性對(duì)照及樣品核酸模板前應(yīng)先瞬時(shí)離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底；謹(jǐn)慎開啟反應(yīng)管，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染；

2）對(duì)于熒光PCR 檢測(cè)，八字原則必須遵守：避光、低溫、快速、蓋緊；即避免強(qiáng)光直接照射反應(yīng)管，在冰盒上配制反應(yīng)體系，加入核酸模板后應(yīng)盡快上機(jī)，上機(jī)前檢查反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器；

3）檢測(cè)過程中用過的吸頭請(qǐng)直接丟入裝有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi)，與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄，在檢測(cè)結(jié)束后用核酸去除劑噴灑實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面（圖4）。

圖3 10ul 不同長(zhǎng)度的移液器吸頭

圖4 核酸清除劑