王守經(jīng) 杜鵬飛 王維婷 柳堯波 胡鵬 汝醫(yī) 孫蘇軍

摘要：為了解不同溫度下貯藏羊肉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，明確溫度條件對(duì)羊肉細(xì)菌多樣性的影響，本試驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)，分析冷藏（0±4）℃和冰溫（-1.2±1）℃貯藏條件下羊肉菌群的多樣性變化。結(jié)果表明，14個(gè)樣品共獲得優(yōu)質(zhì)序列591 754條，在6個(gè)分類學(xué)水平上共獲得17 306個(gè)分類操作單元（OUT）;不同貯藏條件下，羊肉樣品細(xì)菌的豐富度和多樣性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)，冰溫貯藏細(xì)菌群落的改變更明顯;貯藏后期，羊肉優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes），其中冷藏條件下分別占細(xì)菌總數(shù)的99.6%和0.4%，冰溫條件下為75.5%和24.5%。

關(guān)鍵詞：羊肉;細(xì)菌菌群;高通量測(cè)序;冷藏;冰溫貯藏

中圖分類號(hào)：S826：TS251.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）01-0085-06

Study on Bacterial Diversity of Mutton

under Different Storage Temperature

Wang Shoujing， Du Pengfei， Wang Weiting， Liu Yaobo， Hu Peng， Ru Yi， Sun Sujun

（Institute of Agro-Food Sciences and Technology， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology of Shandong Province/Key Laboratory of

Novel Food Resources Processing， Ministry of Agriculture， Jinan 250100， China）

Abstract?In this study， high-throughput sequencing technology was applied to investigate the structures of the bacterial communities of mutton stored under different temperature conditions and determine the effects of temperature conditions on bacterial diversity. The changes in the bacterial diversity of stored mutton under conditions of （0±4）℃ （refrigerated） and （-1.2±1）℃ （ice temperature） were measured. The results showed that a total of 591 754 high-quality sequences and 17 306 classification operation units （OUT） were obtained from 14 samples at 6 taxonomic levels. The bacterial richness and diversity of mutton samples showed a downward trend with the prolongation of storage time in different storage condition， and the change of bacterial community in ice temperature storage was more obvious. Proteobacteria and Firmicutes were the dominant bacteria community in the late storage period， and they accounted for 99.6% and 0.4% respectively under cold storage conditions， and were 75.5% and 24.5% under ice temperature conditions.

Keywords?Mutton; Bacterial community; High-throughput sequencing; Cold storage; Ice temperature storage

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵因素之一。控制溫度來提高畜禽肉品質(zhì)量和延長(zhǎng)保質(zhì)期，已成為畜禽肉類生產(chǎn)加工業(yè)的重要技術(shù)措施。目前我國(guó)肉品最普遍的產(chǎn)品形式正由冷凍肉、熱鮮肉向冷鮮肉轉(zhuǎn)換。冷鮮肉是指經(jīng)過宰后成熟的畜禽分割肉，其貯藏、運(yùn)輸和銷售過程一直處于?（0±?4）℃的低溫冷鏈條件下，可以很好地保持肉的新鮮度和風(fēng)味，貨架期一般可達(dá)5～7 d或更長(zhǎng)。另一種形式的低溫肉是冰鮮肉，它是近幾年興起的一種新型食品貯藏保鮮技術(shù)。該技術(shù)把貯藏溫度控制在0℃以下到該產(chǎn)品冰點(diǎn)之間的范圍內(nèi)，從而更高效地控制微生物生長(zhǎng)和其他質(zhì)量指標(biāo)劣變，這項(xiàng)技術(shù)在不同食品上的應(yīng)用研究已取得很大進(jìn)展[1]。研究發(fā)現(xiàn)，冰鮮羊肉的貨架期可以達(dá)到20 d以上[2，3]，而控制溫度與真空包裝、復(fù)合保鮮劑處理、有機(jī)酸處理等協(xié)同技術(shù)措施相結(jié)合能夠獲得更好的肉品保鮮保質(zhì)效果[4-6]。

宏基因組學(xué)技術(shù)作為一種新興的分子生物學(xué)工具，可以直接從樣品中提取微生物的總DNA，通過高通量測(cè)序分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和功能性等信息的解析，既避免傳統(tǒng)方法在微生物多樣性研究中的局限性，又能夠更客觀地反映研究對(duì)象中微生物原始群落構(gòu)相及動(dòng)態(tài)變化過程，這項(xiàng)技術(shù)在許多領(lǐng)域已經(jīng)開展廣泛的研究工作[7-14]，但對(duì)羊肉貯藏過程中細(xì)菌多樣性的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)對(duì)冷藏及冰溫兩種貯藏條件下細(xì)菌群落多樣性及其變化動(dòng)態(tài)進(jìn)行研究，旨在為冷鮮和冰鮮羊肉產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用羊?yàn)樾∥埠?。選擇12～15月齡的去勢(shì)公羊，宰后于0～4℃條件下成熟24 h，取后腿肉作試驗(yàn)樣品。

1.2?主要試劑與儀器

DNA快速提取試劑盒（Fast DNA SPIN extraction kits）購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司;引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成;Illumina MiSep，美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品;NanoDrop ND-1000 分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品;BCD-215KS型冷藏箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品;LRH-100CL低溫培養(yǎng)/貯藏箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?樣品處理編號(hào)?砧板等用具于試驗(yàn)前均用75%乙醇消毒，分割刀具隨時(shí)用75%乙醇消毒處理。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求進(jìn)行樣品分割處理，剔除脂肪、筋膜后切分成5 g左右的肉塊，分別裝入無菌PE自封袋中密封，后放入冷藏（0±4）℃和冰溫（-1.2±1）℃條件下貯藏。貯藏當(dāng)天取樣，冷藏樣品每隔3 d取樣一次，冰溫貯藏樣品每隔7 d取樣一次。每次取出的樣品，編號(hào)后立即放入?-70℃?超低溫冰箱中存儲(chǔ)，樣品編號(hào)詳見表1。

1.3.2?DNA提取?利用DNA快速提取試劑盒提取樣品細(xì)菌總DNA，運(yùn)用NanoDrop ND-1000型分光光度計(jì)進(jìn)行宏基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化分離，提取的DNA樣品貯藏在-20℃條件下備用。

1.3.3?16S rDNA PCR擴(kuò)增?對(duì)貯藏過程中羊肉表面細(xì)菌菌落V4-V5區(qū)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物為515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3），反向引物907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′），7 bp的樣本特異性條形碼被加入到引物中進(jìn)行多重測(cè)序。PCR反應(yīng)體系25 μL：5×Q5 reaction buffer 5 μL， 5×Q5 High-Fidelity GC buffer 5 μL，5 U/μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL， 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L引物2 μL，模板DNA 2 μL和?8.75μL雙蒸水。PCR反應(yīng)程序：98℃熱變性?2 min?;98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán);72℃延續(xù)反應(yīng)5 min。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步純化定量。

1.3.4?上機(jī)測(cè)序?定量混合好的擴(kuò)增產(chǎn)物利用Illumina MiSeq測(cè)序儀測(cè)序，進(jìn)行生物信息分析。本試驗(yàn)的測(cè)序工作和生物信息分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4?數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)用QIIME 1.7軟件進(jìn)行過濾處理，運(yùn)用Mothur 1.31.2軟件進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)，去除長(zhǎng)度≤150 bp的序列、嵌合體序列等無效序列。在97%相似性水平下劃定閾值，對(duì)有效序列劃分操作分類單元（OTU），構(gòu)建稀釋曲線。

基于物種豐度的分析，應(yīng)用Mothur 1.31.2軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)中的豐富度（Chaol、Ace指數(shù)）、覆蓋率（Coverage）和多樣性（Simpson、Shannon指數(shù)）。根據(jù)OUT的結(jié)果及分布，得到樣品在各個(gè)分類學(xué)水平上（門、綱、目、科、屬、種）的構(gòu)成比例，進(jìn)一步進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?樣品測(cè)序結(jié)果及優(yōu)質(zhì)序列分布

通過對(duì)樣品細(xì)菌16S rDNA V4-V5區(qū)基因擴(kuò)增，測(cè)序過程中會(huì)產(chǎn)生許多點(diǎn)突變等測(cè)序錯(cuò)誤，為保證后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要按照一定的原則對(duì)獲得的有效序列進(jìn)行更進(jìn)一步的過濾和除去嵌合體處理，得到用于結(jié)果分析的優(yōu)質(zhì)序列（表2）。14個(gè)樣品優(yōu)質(zhì)序列比例均在95%以上，這說明測(cè)定結(jié)果可信度高，能夠比較準(zhǔn)確地反映細(xì)菌菌群的豐度情況。隨著貯藏時(shí)間的增加，冷藏樣品和冰溫貯藏的序列數(shù)均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，表明羊肉樣品表面菌群豐度降低，趨于簡(jiǎn)單化。

試驗(yàn)共測(cè)得優(yōu)質(zhì)序列591 754條，序列長(zhǎng)度集中分布在223～227 bp，其中數(shù)量最多的是225 bp（圖1）。本試驗(yàn)測(cè)得結(jié)果的分布與所測(cè)16S rDNA的V4-V5區(qū)的條帶長(zhǎng)度相吻合。

2.2?操作分類單元及稀釋曲線

由表3可以看出，在相似度97%條件下14個(gè)樣品細(xì)菌總的OUT數(shù)量是17 306個(gè)，在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)分類水平上的分布，分別是?4 054、?4 035、3 855、3 130、1 838個(gè)和390個(gè)，無注釋信息的4個(gè)。

在小于5 000條序列時(shí)，A2-1、A1-1和?A-1?-2樣品的OUT數(shù)量隨樣品序列數(shù)的增加迅速上升，A、A-1-3和A-2-3樣品OUT上升速度次之，其他樣品OUT的增加速度緩慢。在?5 000～?10 000個(gè)序列范圍內(nèi)，僅有A2-1樣品OUT數(shù)量增加較快，但速度較前期下降，其他樣品基本趨于平緩，此后所有樣品均趨于平緩（圖2）。說明本研究的取樣深度足夠，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)地反映樣品表面的細(xì)菌群落情況。無論是冷藏還是冰溫貯藏，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品稀釋曲線的變化更加平緩，冰溫貯藏樣品尤其明顯。

2.3?Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是指特定生態(tài)系統(tǒng)或區(qū)域內(nèi)的多樣性，OUT反映了樣品細(xì)菌種類的豐富程度，而Chaol、Ace指數(shù)和Simpson、Shannon指數(shù)則表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化情況。由表4可以看出，無論是從A至A-1-6的冷藏樣品還是A至?A-2-7?冰溫貯藏樣品，其Chaol、Ace指數(shù)和Simpson、Shannon指數(shù)的變化情況是一致的，均呈先升高后下降趨勢(shì)。從不同貯藏條件的影響來看，冷藏較冰溫貯藏樣品表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更豐富。隨著貯藏期的延長(zhǎng)，總體來看樣品細(xì)菌多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單。

2.4?不同貯藏條件下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

由表5可以看出，不同貯藏條件對(duì)各個(gè)分類水平細(xì)菌種類數(shù)量的影響作用不同。在（0±4）℃下，與對(duì)照A相比， A1-1、A-1-2樣品細(xì)菌種類的數(shù)量，除在屬和種水平以外，其他水平上都是增加的，而后又減少。在冰溫貯藏條件下，A2-1樣品出現(xiàn)種群數(shù)量增加，A2-2樣品則下降，而后隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，不同樣品細(xì)菌種類數(shù)量小幅上升再下降。

門分類水平上統(tǒng)計(jì)得到42個(gè)細(xì)菌類群分布（圖3），其中優(yōu)勢(shì)類群依次是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），分別占總數(shù)的76.3%、17.6%、1.5%和1.3%。在?A-1-6?樣品中Proteobacteria的比例高達(dá)?99.6%、?Firmicutes僅為0.4%，而在A-2-7樣品中Proteobacteria的比例為75.5%、Firmicutes為?24.5%。

進(jìn)一步的分析結(jié)果表明，在屬分類水平上統(tǒng)計(jì)得到的細(xì)菌數(shù)量多達(dá)540個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)菌群依次是莫拉氏菌屬（?Moraxellaceae?）、假單胞菌屬（?Pseudomonas?）、涅瓦均屬（?Nevskia?）、熱死環(huán)絲菌屬（?Brchothrix?）和芽孢桿菌屬（?Bacillas?），分別占總數(shù)的28.7%、25.7%、12.3%、10.4%和2.1%。從菌群分布情況看冷藏和冰溫貯藏后期的優(yōu)勢(shì)菌群非常明顯，以?Moraxellaceae?和?Pseudomonas?為主，其中A-1-6樣品?Moraxellaceae?占98.4%、?Pseudomonas?占0.4%，在A-2-7樣品中則為74.4%和0.9%，兩者的差別主要表現(xiàn)在?Brochothrix?的數(shù)量上，A-1-6樣品為0.3%，A-2-7樣品則高達(dá)24.4%，說明溫度條件對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響非常明顯。

3?討論與結(jié)論

江蕓等[15]研究認(rèn)為，肉的腐敗很大程度上取決于初期自身假單胞菌的含量。王寧[16]研究發(fā)現(xiàn)冷卻羊肉的腐敗菌中，假單胞菌占29.25%。假單胞菌屬是一種需氧嗜冷性細(xì)菌，在低溫有氧條件下很快就發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌群，冷鮮肉的腐敗絕大多數(shù)是由假單胞菌的大量繁殖引起的，在冷藏條件下貯藏末期假單胞菌數(shù)量會(huì)占到腐敗菌的90%以上。熱死環(huán)絲菌是一重要的肉類腐敗菌，具有微需氧特性，它在引起無氧包裝肉的腐敗中起到重要作用，它是一種在低溫下能夠快速繁殖的腐敗微生物，通常被認(rèn)為是在冷藏條件下引起真空包裝產(chǎn)品腐敗的主要微生物[17]。本試驗(yàn)得出，無論是冷藏還是冰溫貯藏，羊肉中優(yōu)勢(shì)菌群非常明顯，變形菌門的假單胞菌和厚壁菌門的熱死環(huán)絲菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，由于受不同溫度的影響，兩種細(xì)菌的比例變化較大。本試驗(yàn)雖采用有氧包裝，但冰溫貯藏條件下羊肉的貯藏期更長(zhǎng)，其原因是，隨著氧氣的消耗假單胞菌的生長(zhǎng)繁殖受到抑制，熱死環(huán)絲菌快速生長(zhǎng)繁殖，造成冰溫貯藏羊肉中熱死環(huán)絲菌的比例大大高于冷藏羊肉。

本試驗(yàn)綜合分析可得，在冷藏和冰溫條件下，羊肉中腐敗細(xì)菌的豐度和菌群多樣性均隨貯藏時(shí)間的增加呈逐漸下降趨勢(shì)，冰溫貯藏下更加明顯;在門分類水平上，冷藏18 d時(shí)羊肉中的優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門（Proteobacteria，99.6%）和厚壁菌門（Firmicutes，0.4%），冰溫貯藏49 d時(shí)優(yōu)勢(shì)菌群仍然是Proteobacteria和Firmicutes，分別占75.5%和24.5%，這表明冷藏和冰溫條件對(duì)貯藏后期細(xì)菌的菌群構(gòu)成產(chǎn)生了明顯影響。

參?考?文?獻(xiàn)：

[1]李林，申江，王曉東. 冰溫貯藏技術(shù)研究[J]. 保鮮與加工，2008，45（2）：38-41.

[2]王守經(jīng)，王維婷，胡鵬，等.羊肉冰溫貯藏技術(shù)研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（4）：124-128.

[3]杜曼婷，李培迪，李欣，等.冰溫貯藏結(jié)合不同包裝方式對(duì)羊肉品質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2016， 37（14）：324-328，343.

[4]王守經(jīng)，王維婷，柳堯波，等.不同涂膜劑處理對(duì)冷鮮羊肉貯藏品質(zhì)的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，50（2）：128-132.

[5]趙菲，荊紅彭，伍新齡，等.不同氣調(diào)包裝結(jié)合冰溫貯藏對(duì)羊肉保鮮效果的影響[J].食品科學(xué)，2015， 36（14）：232-237.

[6]馬美湖，婁愛華，郭愛玲，等.分割托盤小包裝冷卻肉保鮮技術(shù)研究[J].肉類研究，2008，22（2）：60-67.

[7]孫丹丹，盧士玲，李開雄，等.貯藏溫度對(duì)冷鮮羊肉微生物菌群生長(zhǎng)變化的影響[J].食品工業(yè)科技，2017，38（4）：327-331，341.

[8]江蕓. 托盤和真空包裝冷卻豬肉冷藏過程中菌相變化規(guī)律研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[9]南春燕，馬雅軍，徐建農(nóng)，等.中華按蚊幼蟲腸道細(xì)菌宏基因組的組成研究[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2013，31（2）：114-119.

[10]孟良艷，陳秀琴，石達(dá)友，等.四君子湯對(duì)脾虛大鼠腸道菌群多樣性的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（12）：2029-2035.

[11]韓亞飛，伊文慧，王文波，等.基于高通量測(cè)序技術(shù)的連作楊樹人工林土壤細(xì)菌多樣性研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2014，49（5）：1-6.

[12]施荷，胡鐵軍，陳鳳賢，等.真空包裝冷卻鹿肉貯藏過程中的菌相變化[J].肉類研究，2015，29（4）：15-19.

[13]李欣，王彥華、林靜怡，等.高通量測(cè)序技術(shù)分析醬香型白酒酒醅的微生物多樣性[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，33（1）：51-59.

[14]Li Y， Liu X Y， Ma M M，et al. Changes in intestinal microflora in rats with acute respiratory distress syndrome[J]. World Journal of Gastroenterology，2014，20（19）： 5849-5858.

[15]江蕓，高峰，徐幸蓮，等.冷卻豬肉不同前處理對(duì)細(xì)菌DNA提取及PCR-DGGE的影響[J].食品科學(xué)，2010，31（6）：?258-?262.

[16]王寧.冷卻羊肉腐敗菌菌相變化及其控制技術(shù)研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[17]阮貴萍.高氧氣調(diào)包裝生鮮調(diào)理豬肉保鮮及菌相變化規(guī)律研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.