黃少梅 張亞楠 楊萬里 何建峰
(1佛山市第三人民醫(yī)院 廣東 佛山 528041)
(2廣州康盛生物科技有限公司 廣東 廣州 510663)
(3廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣東 廣州 510006)
冬凌草甲素是冬凌草中抗癌效果最強(qiáng)的成分,且副作用小,它在癌癥方面的治療作用[1]已經(jīng)引起人們的高度重視。分子印跡技術(shù)是一種制備對模板分子具有高度識別能力聚合物的技術(shù)。制備過程簡單,制備的聚合物性質(zhì)穩(wěn)定,因此在藥物分離,固相萃取,生物傳感器等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[2]。本研究用冬凌草甲素作為模板分子,4-乙烯基苯硼酸為功能單體,采用可逆共價(jià)結(jié)合方式制備對冬凌草甲素具有高度識別能力的分子印跡聚合物。
冬凌草甲素(Oridonin,規(guī)格98%,澤朗植提);4-乙烯基苯硼酸(規(guī)格80%,天津阿法埃莎化學(xué)有限公司);二乙烯基苯(DVB,AR,上海阿拉丁試劑有限公司,使用前減壓蒸餾);其他試劑均為AR。
稱取0.0365g(0.1mmol)冬凌草甲素模板分子,0.0140g(0.1mmol)功能單體4-乙烯基苯硼酸,溶于30mL 1,4-二氧六烷(H2SO4作為催化劑)于88℃下攪拌回流1h,5000rpm-1離心30分鐘,用少量甲醇洗后干燥得預(yù)聚體。將預(yù)聚體溶液轉(zhuǎn)入到試管中,依次加入0.746g(5.73mmol)DVB或0.547g(2.76mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA,0.01g 0.06mmol)偶氮二異丁腈(AIBN)及2.0mL的1,4-二氧六烷,然后通氮10min,密封后置于65℃水浴中恒溫反應(yīng)36h。反應(yīng)得到白色塊狀聚合物,將聚合物研磨并過120目篩,得聚合物微粒。用甲醇-鹽酸(pH=3)(v/v,7∶3)洗脫,直至抽提液經(jīng)紫外檢測無模板分子吸收為止。得到的分子印跡聚合物(MIP)在65℃下真空干燥24h,備用。
空白聚合物NIP的制備方法同上,但不加模板分子。
2.2.1 動力學(xué)吸附研究 準(zhǔn)確稱取六份10mg MIP置于10mL磨口錐形瓶中,分別加入2mL 2mmol·L-1冬凌草甲素的甲醇-磷酸緩沖液(pH=7.40)(v/v,7∶3)標(biāo)準(zhǔn)溶液,置于磁力攪拌器中攪拌,分別于5min、15min、30min、1h、3h、5h收集樣品,用0.22μm微孔濾膜過濾,經(jīng)紫外光度法檢測濾液中待測物的濃度,計(jì)算出聚合物在各時(shí)間點(diǎn)對模板分子的吸附量Q(μmol·g-1)。
2.2.2 聚合物的底物選擇性研究 準(zhǔn)確稱取五份10mg MIP和NIP分別置于10mL磨口錐形瓶中,分別加入2mL 2mmol·L-1冬凌草甲素、5-氟尿嘧啶、氯霉素、苯基-1,2-乙二醇、茶堿的甲醇-磷酸緩沖液(pH=7.40)(v/v,7∶3)標(biāo)準(zhǔn)溶液,室溫下攪拌24h,用0.22μm微孔濾膜過濾,經(jīng)紫檢測濾液中待測物的濃度,計(jì)算出聚合物對模板分子的吸附量Q(μmol·g-1)。
聚合物中冬凌草甲素和功能單體是以可逆共價(jià)鍵的方式結(jié)合的,性質(zhì)較穩(wěn)定。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),甲醇-水溶液和pH=3.0的鹽酸對酯鍵的水解具有促進(jìn)作用,因此對洗脫條件進(jìn)行以下探討:首先,采用甲醇-鹽酸(pH=3.0)(v/v,1∶1)在常溫下攪拌洗脫24h,通過紫外分光光度計(jì)檢測發(fā)現(xiàn)洗脫率較低。隨后將聚合物于60℃攪拌回流,洗脫率明顯增加,結(jié)合冬凌草甲素在水中的溶解度較低,研究最后采用甲醇-鹽酸緩沖液(pH=3.00)(v/v,7∶3)為洗脫劑,于60℃攪拌回流,其洗脫率最高。
MIP(洗脫前)IR數(shù)據(jù)(3438.56,1723.30,1141.64,1071.06,989.04cm-1);MIP(洗脫后)IR數(shù)據(jù)(3441.30,1138.18,1068.77,992.33cm-1)。對照兩者紅外光譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),未洗脫的MIP存在一個(gè)羰基峰(1723.30cm-1),即模板分子冬凌草甲素的羰基峰,洗脫干凈的MIP的紅外光譜圖上未出現(xiàn)冬凌草甲素羰基峰。結(jié)果顯示,MIP中的模板分子被完全洗脫液徹底去除。此外,空白聚合物的紅外光譜圖,NIP:IR(3437,1152.06,1075.25,989.10cm-1),由于空白聚合物與洗脫后MIP結(jié)構(gòu)組分相同,而兩者的紅外光譜圖其主要特征峰基本保持一致。
3.3.1 動力學(xué)吸附 動力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MIP的吸附在5 h后已逐漸趨向平衡,共吸附74.1μmol·g-1,其中,5min可達(dá)到平衡吸附量的15.3%(11.31μmol·g-1),15 min可達(dá)到平衡吸附量的39.6%(29.34μmol·g-1)。
3.3.2 選擇性吸附 聚合物對底物的結(jié)合分配系數(shù)科描述為Kd=CP/CS,式中CP(μmol/g)為底物在聚合物上的結(jié)合量;CS(mmol·L-1)為平衡吸液中底物的濃度。分離因子α描述為α=Kdi/Kdj,式中Kdi/Kdj分別為模板與結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)合分配系數(shù)。Kd值越高,表示聚合物對該底物的結(jié)合量越大;ɑ值越高,表示聚合物對底物的選擇性越好。
硼酸基團(tuán)對1,2-順式二醇比其他醇類選擇性更強(qiáng)。根據(jù)這一理論特點(diǎn),我們分別選取具有1,3-二醇化合物氯霉素、5-氟尿嘧啶,1,2-鄰二醇基團(tuán)的化合物苯基-1,2-乙二醇和冬凌草甲素作為聚合物的底物,對其選擇性進(jìn)行探討。見表。
表1 聚合物對不同底物的選擇性
聚合物:10mg;底物濃度:2mmol·L-1;底物用量=2mL;吸附溶劑:甲醇-磷酸緩沖液(pH=7.40)(V/V,7∶3);吸附時(shí)間:24小時(shí);吸附溫度25℃。
從表可看出,MIP對冬凌草甲素的吸附能力優(yōu)于其他三種底物,表現(xiàn)出較好的選擇性。其中5-氟尿嘧啶空間結(jié)構(gòu)較小,較易進(jìn)入MIP孔穴結(jié)構(gòu)中,Kd值較大。MIP與冬凌草甲素官能團(tuán)互補(bǔ)的功能基團(tuán),再加上與其立體結(jié)構(gòu)相互補(bǔ)的特定形狀的孔穴,使得MIP對冬凌草甲素顯示出特效的選擇結(jié)合特性。NIP數(shù)據(jù)中顯示,NIP對1-苯基-1,2-乙二醇也有較強(qiáng)的結(jié)合能力,這是由于冬凌草甲素與1-苯基-1,2-乙二醇都具有鄰二醇結(jié)構(gòu),在NIP表面與4-乙烯基苯硼酸的結(jié)合能力基本相同,但不具有孔穴結(jié)構(gòu)的記憶選擇性。據(jù)此,我們可以推測是模板分子冬凌草甲素的順式鄰二醇基團(tuán)與功能單體4-乙烯基苯硼酸的硼酸基團(tuán)相互作用,并最終在聚合物的孔穴中產(chǎn)生了識別位點(diǎn)。
本研究第一次以4-乙烯基苯基硼酸作為功能性單體,二乙烯基苯作為交聯(lián)劑制備出冬凌草甲素的共價(jià)分子印跡聚合物。在吸附實(shí)驗(yàn)中采用可逆共價(jià)特異性結(jié)合的冬凌草甲素分子印跡聚合物不僅顯示出較快的吸附動力學(xué)速率和專一識別性能,且較利用分子間氫鍵結(jié)合的印跡聚合物[3]有更高的吸附量。這項(xiàng)研究也為具有順式二醇結(jié)構(gòu)的中藥活性成分分離純化提供了重要參考。