廉葦佳，雷 靜，韓 琛，陳 雅，吳 斌，阿依加馬麗·加帕爾

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院吐魯番農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆吐魯番838000；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003）

葡萄干因其擁有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和較強(qiáng)的抗氧化能力而廣受歡迎[1-2]，葡萄干的營(yíng)養(yǎng)成分來源于葡萄，蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在葡萄干制過程中含量增加，也有一些抗氧化物質(zhì)被分解或轉(zhuǎn)化[3]，其中酚類物質(zhì)是主要的抗氧化物質(zhì)之一，包括酚酸、黃烷-3-醇、黃酮醇和花青素[4]。新疆吐魯番地區(qū)是我國(guó)無核白葡萄干的主產(chǎn)區(qū)，但由于無核白葡萄干在制干與貯藏過程酚類物質(zhì)極易被氧化，導(dǎo)致其品質(zhì)下降，經(jīng)濟(jì)效益降低[5]。目前，對(duì)于葡萄干中總酚的提取，提取方法、溶劑、時(shí)間、溫度等都有很大不同[6-8]，如Susana Sério[9]等用甲醇∶甲酸=97∶3（v/v）室溫下避光攪拌30 h提取，耗時(shí)長(zhǎng)且溶劑消耗量大；Antonia Chiou[10]等用甲醇為提取溶劑，1∶20（g∶mL）料液比超聲水浴 15 min，攪拌24 h，離心，收集濾液的方法提取葡萄干中酚類物質(zhì)，耗時(shí)較長(zhǎng)，工序復(fù)雜；Dongyan Shao[11]等將葡萄干在80%vol乙醇中研磨，超聲30 min，0.22 μm過濾器過濾，測(cè)定多酚類物質(zhì)含量，研磨費(fèi)時(shí)費(fèi)力且存在誤差。而超聲波輔助溶劑浸提操作簡(jiǎn)便、能耗低，可在一定程度上提高提取效率[1]。本研究采用超聲波輔助法提取吐魯番無核白葡萄干中的總酚物質(zhì)，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用葡萄干資源和優(yōu)化葡萄干制干工藝提供理論依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：葡萄干品種為無核白，購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番市高昌區(qū)吐魯番葡萄干交易市場(chǎng)，生產(chǎn)日期為2017年9月中旬。

試劑：福林酚試劑(FC顯色劑)，美國(guó)Sigma公司；沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、無水乙醇、無水碳酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

儀器設(shè)備：數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE（40 kHz）型），昆山市超聲儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)（Specord 50型），德國(guó)Analytic Jena公司；電子分析天平（BS214D型），北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；德國(guó)Hettich臺(tái)式離心機(jī)（MIKRO 200R型），德國(guó)Hettich科學(xué)儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（SHA-C型），金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄干總酚的提取

稱取一定量葡萄干，加入液氮，用帶不銹鋼杯的打漿機(jī)打成粉末，迅速置于-86℃超低溫冰箱中保存[12]。取葡萄干粉末1 g，按不同料液比加入提取溶劑，搖勻，放在超聲波清洗器中于200 W功率條件下進(jìn)行超聲波輔助提取，提取完成后離心分離，收集上清液，定容后測(cè)定提取液中的總酚含量，并按以下公式計(jì)算提取率。

式中：c——標(biāo)曲計(jì)算得出的待測(cè)液中總酚質(zhì)量濃度，μg/mL；v——提取液體積，mL；n——稀釋倍數(shù)；m——稱取葡萄干粉末質(zhì)量，g。

1.2.2 提取溶劑及體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取 20%vol、40%vol、60%vol、80%vol、100%vol乙醇，20%、40%、60%、80%、100%甲醇和蒸餾水為提取溶劑，以1∶10的料液比，在20℃下超聲水浴提取60 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測(cè)定總酚含量，選取總酚提取率最高的溶劑及體積分?jǐn)?shù)作為提取劑及體積分?jǐn)?shù)。

1.2.3 料液比對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，分別以1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 的料液比，在20℃下超聲水浴提取60 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測(cè)定總酚含量，選取總酚提取率最高的料液比作為提取料液比。

1.2.4 提取溫度對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，以1∶20的料液比，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下超聲水浴提取60 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測(cè)定總酚含量，選取總酚提取率最高的溫度作為提取溫度。

1.2.5 提取時(shí)間對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，以1∶20的料液比，在70℃下超聲水浴提取，提取時(shí)間分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，提取2次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測(cè)定總酚含量，選取總酚提取率最高的時(shí)間作為提取時(shí)間。

1.2.6 提取次數(shù)對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

稱取1.000 g葡萄干粉末，選取60%vol乙醇為提取溶劑，以1∶20的料液比，在70℃下超聲水浴提取80 min，分別提取1次、2次、3次、4次、5次后，以4000 r/min離心10 min，定容后測(cè)定總酚含量，選取總酚提取率最高的次數(shù)作為提取次數(shù)。

1.2.7 葡萄干中總酚提取工藝正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，以葡萄干中總酚提取率為響應(yīng)值，通過5因素4水平正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取總酚的工藝條件。

1.2.8 葡萄干中總酚含量的測(cè)定

參考李靜等[13]的方法略作改動(dòng)。不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋后的樣品溶液1.0 mL，依次加入2.5 mL福林酚試劑，混合均勻，50℃下水浴5 min，加入7.5%的碳酸鈉溶液2 mL，顯色30 min后于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，通過沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑及體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響（圖1）

葡萄干中總酚的提取溶劑以水、甲醇、乙醇為主，由圖1可知，不同溶劑及體積分?jǐn)?shù)對(duì)總酚提取率影響顯著（p＜0.05），乙醇溶液作提取溶劑的提取率最高，其次是甲醇溶液，水溶液作提取溶劑的提取率最低。甲醇溶液及乙醇溶液都有隨著體積分?jǐn)?shù)增大，提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%vol時(shí)，提取率最大，因?yàn)樗崛∧M了生理?xiàng)l件，水-乙醇體系是普遍經(jīng)常發(fā)生的而且是食物補(bǔ)充劑的成分，所以能夠使酚類物質(zhì)溶解較多[14]，因而選擇60%vol乙醇作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑及體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

2.2 料液比對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響（圖2）

由圖2可知，不同料液比對(duì)葡萄干總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。隨料液比增大，總酚提取率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，總酚提取率最大，因?yàn)樵龃蟮牧弦罕扔欣谄咸迅膳c提取溶劑充分接觸，從而提高總酚浸出率。料液比達(dá)到1∶30時(shí)，提取率開始下降，當(dāng)料液比過大時(shí)，總酚溶出量達(dá)到飽和，其他雜質(zhì)溶出增多，反而降低了總酚提取率，過大的料液比使溶劑成本增加，給后續(xù)的分離純化帶來不便，因此葡萄干中總酚提取的料液比以1∶20左右比較適宜。

圖2 料液比對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

2.3 提取溫度對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響（圖3）

由圖3可以看出，提取溫度對(duì)總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。隨著提取溫度的升高，葡萄干中總酚的提取率也隨之逐漸增大，溫度的提高有利于葡萄皮中多酚類物質(zhì)的溶出[15]，但同時(shí)也加速了多酚類化合物的氧化，導(dǎo)致提取率下降。考慮到多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性和節(jié)約能源，避免高溫提取對(duì)多酚物質(zhì)的破壞，選擇70℃作為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

2.4 提取時(shí)間對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響（圖4）

由圖4可知，提取時(shí)間對(duì)總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。在20～80 min內(nèi)，葡萄干中總酚提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但超聲時(shí)間超過80 min后，總酚提取率有所下降。在一定時(shí)間內(nèi)，超聲波有利于提取溶劑進(jìn)入葡萄干中并進(jìn)行細(xì)胞破碎，使得葡萄干中酚類物質(zhì)溶出。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由于超聲波具有較強(qiáng)的機(jī)械剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間作用會(huì)使酚類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)被破壞[16]，多酚物質(zhì)被氧化，提取率降低，超聲時(shí)間延長(zhǎng)也可能會(huì)使原料中的其他物質(zhì)溶出，因此選擇超聲時(shí)間80 min為宜。

表1 超聲波輔助提取葡萄干中總酚正交試驗(yàn)因素水平表

圖4 提取時(shí)間對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

2.5 提取次數(shù)對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響（圖5）

由圖5可以看出，提取次數(shù)對(duì)葡萄干總酚提取率的影響顯著（p＜0.05）。葡萄干中總酚的1次提取率為0.61%，可基本完全提取出葡萄干中的酚類物質(zhì)，提取2～5次對(duì)提取率的增加效果不顯著，過度增加提取次數(shù)不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本而且還會(huì)加大后續(xù)工序的處理量，因此，選擇提取次數(shù)2～3次為宜。

圖5 提取次數(shù)對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響

2.6 葡萄干中總酚提取工藝正交試驗(yàn)

為了得到葡萄干中總酚提取最佳工藝條件，綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)葡萄干中總酚提取率的影響，做5因素4水平正交試驗(yàn)，因素水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2、表3。

表2 超聲波輔助提取葡萄干中總酚正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由正交試驗(yàn)極差分析和方差分析結(jié)果（表2、表3）可以看出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，5個(gè)因素對(duì)葡萄干中總酚提取的影響大小依次為料液比（B）＞提取溫度（D）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞提取時(shí)間（C）＞提取次數(shù)（E），提取溫度（D）對(duì)葡萄干中總黃酮提取有顯著影響（P＜0.05），料液比（B）也對(duì)葡萄干中總酚提取有重要作用，但對(duì)結(jié)果的影響不存在顯著性差異。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到超聲波輔助提取葡萄干中總酚的最佳提取工藝條件為A2B4C3D2E1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、料液比1∶40、提取時(shí)間80 min、提取溫度50℃、提取次數(shù)1次。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，葡萄干中總酚的提取率為0.97%。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

葡萄干中含有重要的抗氧化成分——酚類化合物，應(yīng)用超聲波輔助提取技術(shù)可實(shí)現(xiàn)其中總酚物質(zhì)的快速提取。在200 W超聲功率下，葡萄干中總酚提取的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、料液比 1∶40、提取時(shí)間80 min、提取溫度50℃、提取次數(shù)1次。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，葡萄干中總酚的提取率為0.97%。