司冠儒，張溫清，饒志明，于海波，孔 帥，段亮亮，葉 明，周 萍

（1.安徽宣酒集團(tuán)股份有限公司，江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城242000；2.合肥工業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽合肥230009；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

吡嗪類化合物是一類含1,4-二氮雜苯母環(huán)化合物的總稱，廣泛存在于自然和發(fā)酵食品中，具有類似于炒堅果、烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對其他香味有顯著的烘托和疊加作用。四甲基吡嗪(TTMP)，又名川芎嗪，是一種重要的吡嗪化合物。它作為中藥材川穹根莖的主要活性生物堿成分，具有特殊的藥理作用。研究表明，TTMP具有擴(kuò)張血管、改變血循環(huán)、護(hù)肝（防止酒精對胃黏膜和肝臟的損傷）等功能[1-2]。醬香型、兼香型和芝麻香型白酒中富含吡嗪類物質(zhì)，特別是TTMP，其主要由發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生，是中國白酒中的健康風(fēng)味成分，為“適量飲酒，有益健康”提供了依據(jù)[3-4]。

近年來，針對白酒中TTMP檢測方法的研究已有很多的相關(guān)報道，氣相色譜技術(shù)、液相色譜技術(shù)及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)均應(yīng)用于該領(lǐng)域中[5-7]。建立簡便準(zhǔn)確的TTMP含量測定方法，對進(jìn)行白酒中TTMP的研究工作，白酒廠日常的分析檢驗及自身品牌提升具有重要的意義。本研究團(tuán)隊前期針對芝麻香型白酒中TTMP做了系統(tǒng)的研究，相繼開發(fā)了TTMP檢測的氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，并對芝麻香型白酒整個生產(chǎn)工藝過程中TTMP的產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行了深入的研究[8-11]。本文擬對氣相色譜技術(shù)、液相色譜技術(shù)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量檢測芝麻香型白酒中TTMP的方法進(jìn)行研究，分析3種方法的優(yōu)缺點，以期為不同兄弟廠家根據(jù)自身的設(shè)備配置和人員素質(zhì)建立TTMP的日常分析檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：待測酒樣均為本廠產(chǎn)芝麻香型白酒。

儀器設(shè)備：氣相色譜儀，日本SHIMADZU GC-2010 Plus，配有 FID 檢測器；色譜柱，Varian，CP 97723A，50 m×0.25 mm×0.39 mm；氫氣發(fā)生器QL-500，山東賽克賽斯氫能源有限公司；空氣發(fā)生器HGA-5L，北京匯龍公司；高純氮氣，南京特種氣體有限公司；液相色譜儀，美國Angilent 1200；色譜柱，Phenomenex Gemini 5 μm C18110A(250×4.60 mm)；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Angilent 1260-6460；色譜柱，Angilent Eclipse Plus C183.5 μm(4.6×100 mm)；電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限責(zé)任公司；微量進(jìn)樣器，日本SHIMADZU。

試劑：內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸，購于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；TTMP（2,3,5,6-TTMP）購自sigma公司；色譜級乙醇、甲醇購于ANPEL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)樣的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的TTMP于容量瓶中，用60%的色譜級乙醇溶解并定容。

1.2.2 酒樣的測定

5 mL的酒樣中加入0.1 mL 2%（v/v）的2-乙基丁酸，混勻，取約1 mL至樣品瓶中，直接用于氣相色譜分析。

吸取3 mL待測酒樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后取約1 mL至樣品瓶中，直接用于液相色譜和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析。

1.2.3 定性與定量方法

氣相色譜分析：通過TTMP標(biāo)樣測定的保留時間及標(biāo)樣組分直接添加來進(jìn)行定性分析；通過在試樣中添加內(nèi)標(biāo)溶液對待測組分進(jìn)行定量分析。

液相色譜分析：通過TTMP標(biāo)樣測定的保留時間及標(biāo)樣組分直接添加來進(jìn)行定性分析；通過外標(biāo)法對待測組分進(jìn)行定量分析。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析：通過TTMP標(biāo)樣測定的保留時間及標(biāo)樣組分直接添加來進(jìn)行定性分析；通過外標(biāo)法對待測組分進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酒樣品中TTMP氣相色譜法檢測條件的確定（圖1）

圖1 氣相色譜法TTMP標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

氣相色譜分析時，TTMP在乙酸后出峰，乙酸在酒中含量較高，在色譜圖中峰展寬度較大。通過研究，發(fā)現(xiàn)載氣流量、分流比、程序升溫的起始溫度及升溫速率對二者的分離效果均產(chǎn)生極其重大的影響，尤其是程序升溫速率。程序升溫速率過慢，容易造成乙酸峰拖尾，TTMP分離效果不好；程序升溫速率過快，則影響TTMP與其后的微量成分的分離，且易對色譜柱造成損害，縮短柱子的使用壽命。經(jīng)過多次實驗，確定了最優(yōu)的色譜條件：進(jìn)樣量為1 μL；載氣為氮氣，流速為0.7 mL/min；分流比為20∶1；進(jìn)樣口溫度為230℃；檢測室溫度為240℃；程序升溫起始溫度40℃，保持3.0 min，然后以15℃/min的升溫速率升溫至200℃，保持20.0 min。在此條件下，TTMP的分離狀況，色譜的運行時間均為最佳。TTMP標(biāo)樣色譜圖見圖1，TTMP的保留時間為18.207 min。

2.2 白酒樣品中TTMP液相色譜法檢測條件的確定（圖2）

圖2 液相色譜法TTMP標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

查閱相關(guān)文獻(xiàn)及對TTMP標(biāo)樣的全波長走讀掃描發(fā)現(xiàn)，TTMP在278 nm處具有最大的特異吸收峰，從而確定其液相檢測波長。對甲醇濃度、色譜柱溫度及流速進(jìn)行了優(yōu)化，確定了白酒中TTMP檢測的最佳色譜條件。當(dāng)70%甲醇作為流動相時，目標(biāo)峰的峰形較為對稱，響應(yīng)也較好，但保留時間過短，TTMP易受白酒中其他基質(zhì)的影響，降低甲醇的濃度可使TTMP的保留時間延長，同時也會降低其響應(yīng)。本研究經(jīng)過多次實驗，確定了流動相中甲醇的最佳濃度為35%。根據(jù)標(biāo)樣中TTMP的保留時間及在酒樣中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，對酒樣中的TTMP進(jìn)行了定性。TTMP標(biāo)樣色譜圖如圖2所示，TTMP的保留時間為16.401 min。

最佳色譜檢測條件：流動相為甲醇∶水（v/v）=35∶65，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，色譜柱為phenomenex Gemini 5 μm C18110A(250×4.60 mm)，進(jìn)樣量為20 μL。白酒樣品過0.22 μm濾膜后，直接進(jìn)樣。

2.3 白酒樣品中TTMP液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測條件的確定（表1、圖3）

表1 MRM檢測參數(shù)表

圖3 液質(zhì)聯(lián)用法TTMP標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

表2 3種方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和回收率

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測條件HPLC條件部分參考了2.2?；贓SI+對流動相的要求，在水相中加入0.1%甲酸，以利于TTMP的離子化，最終確定流動相組成為乙腈∶0.1%甲酸=35∶65，TTMP的響應(yīng)值與分離度均較好，同時保留時間也較短；MS/MS方法參數(shù)部分，裂解電壓(Fragmentor Voltage)主要影響毛細(xì)管末端進(jìn)入MS1的母離子的豐度，碰撞能（Collision Energy）主要影響碰撞池中產(chǎn)生的子離子的豐度，通過對這兩個參數(shù)的優(yōu)化，最后確定的MRM參數(shù)見表1。該分析條件下TTMP標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖見圖3。

2.4 3種方法測定TTMP的精密度分析

在酒樣中添加不同濃度的TTMP，3種方法分別進(jìn)行測定，驗證3種方法檢測白酒中TTMP的回收率、精密度。氣相色譜法檢測白酒中TTMP的回收率為93.33%～98.44%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.39%～3.05%；液相色譜法檢測白酒中TTMP的回收率為94.67%～100.33%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.00%～2.36%；液質(zhì)聯(lián)用法檢測白酒中TTMP的回收率為95.33%～99.67%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.20%～1.76%（表2）。由上述數(shù)據(jù)可知，3種方法檢測芝麻香型白酒中TTMP的重復(fù)性和精確度均較好，可以滿足白酒廠日常檢測分析的要求。

3 結(jié)論

建立了用氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測芝麻香型白酒中的健康功能因子TTMP的方法，并對3種方法檢測TTMP的回收率和精密度進(jìn)行了研究?；厥章屎拖鄬?biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，3種方法測定芝麻香型白酒中TTMP的回收率和精密度均可以滿足檢驗的要求。在日常檢驗工作中發(fā)現(xiàn)，利用氣相色譜法測定芝麻香型白酒中的TTMP，隨著進(jìn)樣數(shù)目的增多，柱效下降，芝麻香型白酒中的乙酸含量較高，造成乙酸在色譜圖中峰展較寬，甚至拖尾，容易影響出峰順序在其后的TTMP的分析測定。液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定芝麻香型白酒中TTMP時，TTMP響應(yīng)較高，出峰前后沒有其他風(fēng)味物質(zhì)的干擾，定性定量更為準(zhǔn)確。且樣品無需前處理直接進(jìn)樣，操作簡便，其中液相色譜法對儀器設(shè)備和技術(shù)人員的素質(zhì)要求較低，更便于推廣。但對于白酒生產(chǎn)工藝過程中基質(zhì)較為復(fù)雜，且TTMP含量較低的曲粉、糟醅等樣品，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有檢出限更低，靈敏度更高，假陽性低的優(yōu)勢，對生產(chǎn)工藝各階段中TTMP的分析及生成機(jī)理研究具有重要意義。