吳秋焱,馬瀚林，張震宇，畢經(jīng)會(huì)，馮婉瀅，李 懿，吳文惠，戰(zhàn) 旗

(山東中醫(yī)藥大學(xué),山東 濟(jì)南 250355)

車前子來(lái)源于車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressssa Willd.的干燥成熟種子， 性甘、寒， 歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)， 具有清熱利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰的功效， 臨床上多用于熱淋澀痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛和痰熱咳嗽[1]?，F(xiàn)代研究表明，車前子的化學(xué)成分為環(huán)烯醚萜類、生物堿類、黃酮類、多糖類、苯乙醇苷類、三萜類以及甾醇類等化合物，其中環(huán)烯醚萜類和黃酮類為其主要化學(xué)成分[2-3]。藥理作用方面，具有鎮(zhèn)咳平喘祛痰、抗炎、抗氧化、利尿、降血糖、降壓、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫以及緩瀉作用[2-4]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠水負(fù)荷模型，收集6h內(nèi)的尿液，測(cè)定尿液中總鹽重量、血尿素氮濃度和碳酸酐酶水平，研究車前子不同炮制規(guī)格的利尿作用，為臨床應(yīng)用提供有效依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇東鵬儀器制造有限公司)；LP 202J型電子天平(常熟市夢(mèng)蘭百靈天平儀器有限公司)；303-O型臺(tái)式培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；GFL-230型恒溫干燥箱(天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司)；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；XD-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Epoch酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司)。

1.2 藥物與試藥

車前子(濟(jì)南市三源藥業(yè)，批號(hào)：171201)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系主任李峰教授鑒定為車前科植物平車前Plantago depressssa Willd.的種子；氫氯噻嗪片(常州制藥廠，批號(hào)：18020611)；大鼠尿素氮(BUN)ELISA試劑盒(中國(guó)酶免公司，批號(hào)：MM-20555R1)；大鼠碳酸酐酶(CA)ELISA試劑盒(中國(guó)酶免公司，批號(hào)：MM-0489R1)；水為純化水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(270±10)g(濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司)，合格證號(hào)：SCXK(魯)20140007。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 車前子不同規(guī)格炮制品的制備

參照《中國(guó)藥典》[1]2015年版一部中車前子的炮制方法，以生車前子為原料，分別得到生車前子、清炒車前子和鹽炙車前子。

2.2 給藥液的制備

稱取生車前子500g，80%乙醇浸泡12h，4倍量80%乙醇回流提取3次，每次2h，過(guò)濾,回收溶劑至干。提取物用0.9%NaCl溶液混懸,分別制成含藥量1.6，0.4，0.1g·mL-1的給藥溶液。清炒與鹽炙車前子給藥液的制備方法同生車前子。陽(yáng)性對(duì)照藥氫氯噻嗪用0.9%NaCl溶液配成0.4mg·mL-1的給藥溶液。

2.3 動(dòng)物篩選

采用Aston法，將實(shí)驗(yàn)鼠預(yù)先禁食(不禁水)18 h ,灌胃去離子水2.5 mL·100g-1,收集2 h 尿量,選擇2 h 出入量比值>40%的鼠繼續(xù)進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)[5]。

2.4 動(dòng)物分組

取上述篩選合格的大鼠55只，隨機(jī)分為11組，每組5只，分別為:空白對(duì)照組(給藥生理鹽水)，陽(yáng)性對(duì)照組(給藥0.4mg·mL-1的氫氯噻嗪)，生車前子醇提物高劑量組(以下簡(jiǎn)稱SCG組，含藥量1.6g·mL-1)、中劑量組(以下簡(jiǎn)稱SCZ組，含藥量0.4g·mL-1)、低劑量組(以下簡(jiǎn)稱SCD組，含藥量0.1g·mL-1)；清炒車前子醇提物高劑量組(以下簡(jiǎn)稱CCG組，含藥量1.6g·mL-1)、中劑量組(以下簡(jiǎn)稱CCZ組，含藥量0.4g·mL-1)、低劑量組(以下簡(jiǎn)稱CCD組，含藥量0.1g·mL-1)；鹽炙車前子醇提物高劑量組(以下簡(jiǎn)稱YCG組，含藥量1.6g·mL-1)、中劑量組(以下簡(jiǎn)稱YCZ組,含藥量0.4g·mL-1)、低劑量組(以下簡(jiǎn)稱YCD組，含藥量0.1g·mL-1)。

將大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠適應(yīng)2天，代謝籠中適應(yīng)3天，實(shí)驗(yàn)前禁食(不禁水)18h，以減少糞便的干擾。每組大鼠按25mL·kg-1體質(zhì)量，用生理鹽水灌胃，造成水鈉潴留狀態(tài)。30min后，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，輕壓動(dòng)物下腹,排盡余尿。各實(shí)驗(yàn)組給予含受試藥物的0.9%氯化鈉溶液25mL·kg-1，空白組給予同體積的生理鹽水。收集大鼠2,4,6h的尿液。連續(xù)給藥6天。第6天給藥1h后處死大鼠，取血約2mL,立即放入低溫離心機(jī)中,1000r·min-1離心5min,得到血清。將血清至于-20℃冰箱冷凍保存。

2.5 尿液中總鹽的測(cè)定

將收集的尿液立即用稱量至恒重的濾紙吸盡，105℃烘干3h，冷至室溫后稱定重量。

2.6 血尿素氮濃度測(cè)定

第6天給藥1h后處死大鼠，取血約2mL,立即放入低溫離心機(jī)中,1000r·min-1離心5min,得到血清。然后按大鼠尿素氮(BUN)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。(如果不是立即實(shí)驗(yàn)，得到血清后要將血清至于-20℃冰箱冷凍保存)。

2.7 碳酸酐酶水平測(cè)定

操作同血尿素氮濃度測(cè)定，血清恢復(fù)原狀后按大鼠碳酸酐酶(CA)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同規(guī)格的車前子醇提物對(duì)大鼠尿液中總鹽的影響

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，2h內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照組、YCZ組有明顯的利尿作用(P<0.05)，SCZ組、SCG組、CCD組、YCG組利尿作用尤其顯著(P<0.01);2～4h，YCD組利尿作用明顯(P<0.05)，CCD組利尿作用尤其顯著(P<0.01);4～6h各組車前子均無(wú)利尿作用。該結(jié)果表明在4小時(shí)以內(nèi)車前子具有利尿作用。利尿作用強(qiáng)弱：鹽炙>清炒>生品。

表1 不同規(guī)格的車前子醇提物尿液中總鹽重量( ±s,n=5) g

表1 不同規(guī)格的車前子醇提物尿液中總鹽重量( ±s,n=5) g

組別2h2～4h4～6h空白對(duì)照組0.108±0.002970.110±0.001900.176±0.00053陽(yáng)性對(duì)照組0.228±0.00497?0.094±0.004430.184±0.00068SCD組0.135±0.002290.058±0.001370.150±0.00110SCZ組0.260±0.00055??0.100±0.002150.142±0.00117SCG組0.236±0.01118??0.145±0.004300.160±0.00127CCD組0.256±0.00033??0.218±0.00087??0.140±0.00385CCZ組0.168±0.000870.076±0.0014130.204±0.00423CCG組0.175±0.009430.120±0.003870.213±0.00036YCD組0.150±0.00570.047±0.00173?0.157±0.00463YCZ組0.214±0.00028?0.104±0.002280.188±0.00137YCG組0.330±0.00025??0.196±0.009080.176±0.00053

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

3.2 不同規(guī)格的車前子醇提物對(duì)大鼠血尿素氮濃度的影響

由表2可看出,各組 尿素氮濃度：SCZ組>YCZ組>SCD組>空白對(duì)照組>陽(yáng)性對(duì)照組>YCG組>CCD組>YCD組>CCG組>CCZ組>SCG組。與空白對(duì)照組相比，SCG組尿素氮濃度有明顯差異(P<0.05)，其他組無(wú)明顯差異，該結(jié)果說(shuō)明高劑量生車前子醇提物(1.6g·mL-1)對(duì)大鼠腎小球過(guò)濾功能有影響[6]。

3.3 不同規(guī)格車前子對(duì)大鼠碳酸酐酶水平的影響

由表3可知，各組碳酸酐酶濃度：SCZ組>SCG組>CCD組>YCZ組>YCG組>SCD組>CCZ組>空白對(duì)照組>CCG組>陽(yáng)性對(duì)照組>YCD組。與空白對(duì)照組相比，YCD組碳酸酐水平有顯著差異(P<0.05)，其他組無(wú)明顯影響。

表3 各組大鼠碳酸酐酶濃度

表3(續(xù))

3.4 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中SCG組、CCG組、YCG組均出現(xiàn)不同程度的腹瀉，其中YCG組腹瀉最嚴(yán)重。SCG組給藥第4天開(kāi)始腹瀉，CCG組、YCG組給藥第一天即出現(xiàn)腹瀉。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較不同組別大鼠尿中總鹽重量，發(fā)現(xiàn)三種炮制規(guī)格的車前子醇提物在0～4h內(nèi)均有明顯的利尿作用，與顏升[7]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。利尿作用強(qiáng)弱為：鹽炙車前子>清炒車前子>生車前子。其中，鹽炙車前子醇提物中，高劑量組利尿作用最明顯；清炒車前子醇提物中，低劑量組利尿作用最明顯；生車前子醇提物中，中劑量組利尿作用最明顯。這可能與車前子炮制后化學(xué)成分發(fā)生了質(zhì)和量的變化[8]有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)蛩氐獫舛葴y(cè)定結(jié)果顯示，高劑量生車前子醇提物對(duì)血尿素氮濃度影響顯著，表明其對(duì)腎小球的過(guò)濾有影響。本實(shí)驗(yàn)碳酸酐酶濃度測(cè)定結(jié)果顯示，低劑量鹽炙車前子醇提物組碳酸酐酶濃度有顯著降低，表明低劑量鹽炙車前子能抑制碳酸酐酶[6]。

此外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)三種炮制規(guī)格的車前子醇提物高劑量組都出現(xiàn)不同程度的腹瀉。與張丹[9]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。經(jīng)比較，張丹等的提取方法為醇水雙提法，給藥濃度為1.0g·mL-1,與本實(shí)驗(yàn)的提取方法和給藥濃度不同，固化學(xué)成分的含量會(huì)有差別，從而得到不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，車前子的致瀉成分為車前子多糖[10-11]，由此可得，本實(shí)驗(yàn)中各高劑量組大鼠出現(xiàn)的腹瀉是由提取物中多糖成分含量較高引起。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同炮制規(guī)格、不同濃度的車前子的利尿作用研究，證實(shí)鹽炙車前子的利尿作用最強(qiáng)，且高濃度的不同炮制規(guī)格車前子都有致瀉作用；車前子利尿作用的有效濃度范圍和致瀉的最低濃度尚不明確，有待進(jìn)一步研究。