曹治云 余旋 魏麗慧 曾建偉 趙錦燕 黃彬 林久茂#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州350122；2福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州350122）

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體正氣不足、臟腑功能失調(diào)及熱毒積聚密切相關(guān)，多因氣滯、血瘀、痰凝、毒聚而形成[1]。中醫(yī)藥在腫瘤的治療中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，已經(jīng)證實(shí)有些中藥具有通過(guò)調(diào)控腫瘤血管生成從而達(dá)到抗腫瘤的功效。清解扶正顆粒（Qingjiefuzheng Granules，QFG）是臨床驗(yàn)方，由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成，其中白花蛇舌草為君，具有清熱解毒、消癰散結(jié)、利尿除濕的功效；半枝蓮為臣，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛的作用，輔助君藥，增強(qiáng)清熱解毒之功效；黃芪為佐，具有補(bǔ)氣健脾、益衛(wèi)固表、利尿消腫、生津的功效，調(diào)和君臣的寒涼之性；麥芽為使，具有行氣消食、健脾開(kāi)胃、退乳消脹的功效，在增強(qiáng)君臣作用之時(shí)，調(diào)和脾胃運(yùn)化，兼顧后天之本。清解扶正顆粒臨床輔助化療藥物治療多種惡性消化道腫瘤，具有改善患者的生活質(zhì)量、減輕胃腸不良反應(yīng)等作用。我們的實(shí)驗(yàn)研究表明QFG對(duì)大腸細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用[2]，但治療大腸癌等惡性腫瘤的作用機(jī)制尚不清楚。故本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，探討了QFG對(duì)血管新生的調(diào)控作用，以期為QFG的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 藥物與細(xì)胞株 清解扶正顆粒（QFG）由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室提供，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成200 mg/ml儲(chǔ)存溶液，超聲30 min助溶，用0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾，再用培養(yǎng)基配成所需要的濃度。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、0.25%胰蛋白酶、二甲亞砜（DMSO）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]干粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；管腔形成試劑盒購(gòu)于德國(guó)Merck Millipore公司，VEGF-A、VEGFR-2購(gòu)于美國(guó) Proteintech公司，MMP-2、MMP-9抗體購(gòu)自中國(guó)BBI Life Sciences公司。

1.3 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica儀器有限公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1、Countes全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Life公司）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVEC分別培養(yǎng)于含10%FBS、1%雙抗（含 100 U/ml青霉素和 100 μg/ml鏈霉素）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，并于37℃、5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至匯合度為80%～90%時(shí)，加入1 ml的胰蛋白酶消化1～3 min，隨后加入2 ml完全培養(yǎng)基終止消化，于離心機(jī)中以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min后，吸棄上清并收集沉淀細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集HUVEC細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為1.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按100 μl/孔的原則均勻地接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)每孔細(xì)胞的匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，輕輕吸走原孔中培養(yǎng)基，隨后每孔分別加入100 μl不同濃度的QFG（終濃度分別為 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/ml，其中 0 mg/ml為對(duì)照組），干預(yù)24 h或48 h后再次吸走原孔中溶液，并加入等體積的MTT溶液（100 μl/孔，0.5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄各孔中的液體，每孔加入等體積DMSO并振蕩混勻，于酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值（A值），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.6 細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察 收集HUVEC細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的QFG（終濃度分別為 0、0.125、0.25、0.5、0.75、1 mg/ml，其中0 mg/ml為對(duì)照組）干預(yù)24 h，并在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 收集HUVEC細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為1.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)到鋪滿(mǎn)單層，用無(wú)菌槍頭在單層細(xì)胞上劃出一字痕，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入含有QFG的培養(yǎng)液后放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，于6 h、18 h、24 h不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量并拍照。

1.8 管腔形成實(shí)驗(yàn) 收集HUVEC細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的QFG（分別為 0、0.25、0.5、0.75 mg/ml），干預(yù) 24 h后，將細(xì)胞收集并配制成2×105細(xì)胞懸液，以1∶1比例加入基質(zhì)膠中孵育3 h后觀(guān)察成血管情況并拍照。

1.9 Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 總蛋白提取后，約50 μg總蛋白進(jìn)行10%和12%的SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后與稀釋一抗（濃度是1∶1 000）4℃孵育過(guò)夜，切膜后緩沖液洗膜3次，每次10 min，室溫下?lián)u床二抗孵育1 h，顯影并拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QFG對(duì)HUVEC形態(tài)的影響 倒置顯微鏡觀(guān)察結(jié)果顯示HUVEC經(jīng)不同濃度的QFG（0.25、0.5、0.75 mg/ml）干預(yù) 24 h 后，與對(duì)照組（0 mg/ml）比較，各濃度藥物均對(duì)HUVEC的形態(tài)和細(xì)胞密度無(wú)明顯影響。該結(jié)果表明濃度≤0.75 mg/ml的QFG對(duì)HUVEC的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。見(jiàn)圖1。

2.2 QFG對(duì)HUVEC活力的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，HUVEC經(jīng)不同濃度的QFG分別干預(yù)處理24 h和48 h后，HUVEC的活力受到不同程度的影響，當(dāng)濃度≥0.75 mg/ml時(shí)，QFG對(duì)HUVEC活力具有明顯的抑制作用，這種作用具有一定的劑量依賴(lài)性，但無(wú)明顯的時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)表1。

表1 QFG對(duì)HUVEC活力的影響（n＝8，±s）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

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2.3 QFG對(duì)HUVEC遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示QFG具有抑制HUVEC損傷修復(fù)能力的作用。劃痕損傷24 h后，對(duì)照組HUVEC的劃痕已經(jīng)鋪滿(mǎn)細(xì)胞，而隨著QFG給藥濃度的不斷增大，給藥組HUVEC細(xì)胞劃痕中間的距離不斷增大，呈濃度依賴(lài)性。該結(jié)果證實(shí)QFG對(duì)HUVEC細(xì)胞遷移能力具有顯著的抑制作用。見(jiàn)圖2。

圖2 QFG對(duì)HUVEC遷移能力的影響（×100）

2.4 QFG對(duì)HUVEC成血管能力的影響 體外成血管實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，QFG處理后的HUVEC成血管能力隨著給藥劑量的增加而逐漸降低，表現(xiàn)出顯著的劑量依賴(lài)關(guān)系，表明QFG具有抑制血管新生的作用。見(jiàn)圖3。

圖3 QFG對(duì)HUVEC成血管能力的影響（×100）

2.5 QFG對(duì)HUVEC細(xì)胞中 VEGF-A、VEGFR-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，QFG對(duì)HUVEC細(xì)胞中VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)具有顯著調(diào)控作用。與對(duì)照組比較，隨著給藥濃度增加，VEGF-A、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)顯著濃度依賴(lài)關(guān)系。見(jiàn)圖4。

圖4 QFG對(duì)HUVEC中VEGF-A、VEGFR-2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的影響

3 討論

實(shí)體腫瘤內(nèi)部血管生成與促血管生長(zhǎng)因子的分泌和表達(dá)直接相關(guān)。目前，研究得較多而又透徹的促血管生長(zhǎng)因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）。其中，VEGF-A在多種正常組織器官如肺、腎、心、卵巢等中均有表達(dá)，同時(shí)它也是促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)的主要因子。VEGF-A通過(guò)增加血管通透性，導(dǎo)致血漿蛋白外漏，大量纖維蛋白酶原聚集后形成臨時(shí)基質(zhì)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular Endothelial Cell，VEC）在血管外得以生存。VEC細(xì)胞的增殖和遷移是血管新生的核心，這與多種促血管生成因子有直接相關(guān)性，如VEGF-A、b-FGF、TGF-α、PDGF、IL-8 等[3～4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)QFG具有抑制HUVEC細(xì)胞活力的作用，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察進(jìn)一步佐證QFG可誘導(dǎo)HUVEC凋亡，同時(shí)抑制HUVEC的遷移及體外成血管能力，初步證實(shí)了QFG具有抑制腫瘤血管新生的作用，這可能是QFG抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

當(dāng)VEGF-A、VEGFR-2與VEC表面整合素αⅤβ3黏合后促進(jìn)VEC增殖，而后在激活基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinas，MMP）作用下，向胞外域遷移[5]?；|(zhì)金屬蛋白酶對(duì)基底膜及壁細(xì)胞的降解起調(diào)控作用，MMPs會(huì)釋放一些胞外基質(zhì)中缺乏的促血管生長(zhǎng)因子，降解血管基底膜，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及腫瘤血管的生成。MMP-2和MMP-9是MMP家族中重要的2個(gè)因子，血管新生啟動(dòng)過(guò)程的重要成員，可通過(guò)促進(jìn)VEGF的釋放及其他血管形成因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管的新生，上調(diào)腫瘤的血管化[6]。有多篇報(bào)道證實(shí)中藥通過(guò)調(diào)控MMPs及VEGF、VEGFR的作用抑制腫瘤血管生成，單體如大黃素、姜黃素、長(zhǎng)春堿、喜樹(shù)堿、苦參堿、去甲斑蝥素、小檗堿、丹參酮、川芎嗪等[7～13]，復(fù)方如六神丸、薏苡仁注射液、參麥注射液、澤瀉飲、鱉甲煎丸等[14～18]。中藥抑制腫瘤血管新生的機(jī)制主要是通過(guò)抑制血管生成因子及其受體的表達(dá)如VEGF、b-FGF、VEGFR等，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物的表達(dá)如MMP、TIMP，抑制黏附及趨化因子的表達(dá)如ICAM、CXCR等，抑制血管新生相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后降低微血管密度。本研究在明確QFG抑制腫瘤血管新生的作用后，進(jìn)一步檢測(cè)其對(duì)促血管生成因子VEGF-A、VEGFR-2及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)調(diào)控，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，QFG 顯著抑制 VEGF-A、MMP-2、MMP-9 核心血管生成因子蛋白的表達(dá)。MMP-2和MMP-9是血管新生啟動(dòng)過(guò)程的重要成員，活化的MMP-2定位于細(xì)胞穿透基質(zhì)的突出部位，MMP-9是以酶原的形式從胞內(nèi)分泌到胞外，在酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分中起重要作用[19]。綜上所述，QFG可能是通過(guò)影響血管生成核心因子的表達(dá)進(jìn)而影響相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，從而達(dá)到抑制腫瘤血管新生作用，相關(guān)結(jié)果還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。