蔣秋燕，王夢(mèng)瑩，王美麗，蔣桂秀，唐乾利，李妹燕△

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023； 2. 右江民族醫(yī)學(xué)院, 廣西 百色 5330001)

針刺鎮(zhèn)痛效果明顯，歷史悠久，中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為通則不痛、榮則不痛是針刺鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制。目前現(xiàn)有的研究證實(shí)，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK) 信號(hào)通路可被應(yīng)激刺激激活，將胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)換至胞核內(nèi)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，而脊髓背脊中的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulated protein kinase，ERK)在疼痛早期活化,參與疼痛的產(chǎn)生和維持[1]。本研究通過(guò)對(duì)分娩大鼠應(yīng)用電針及Real-timePCR、Westernblot檢測(cè)，從MAPK /ERK 信號(hào)通路探討電針?lè)置滏?zhèn)痛作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

電針儀由北京華衛(wèi)公司生產(chǎn)的韓氏穴位神經(jīng)刺激儀LH202H；針灸毫針是天津杏林書(shū)院醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)漢醫(yī)牌0.17 mm × 7 mm；鎮(zhèn)痛藥物由宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的鹽酸瑞芬太尼(批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H20030197)。Roche LightCycler? 480 熒光定量PCR儀，LightCycler? 480 DNA SYBR Green I Master，由生工生物工程上海(股份)有限公司設(shè)計(jì)與合成Real-time PCR引物，購(gòu)于invitrogen公司的TRIzol試劑及購(gòu)于ABI公司DNA Marker的定量PCR試劑ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)，氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、第一鏈cDNA合成試劑盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)DEPC H2O，6×DNA Loading Dye，10×TAE，(400mM Tris-acetate and 10mM EDTA，pH8.0)等試劑均購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 動(dòng)物造模及分組

通過(guò)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)這項(xiàng)研究(reference no. 201302026),所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程都是遵循國(guó)立健康研究院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)原則(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK桂2009-0002)。性成熟未交配，3月齡健康SD大鼠，體質(zhì)量(300±50)g。雌鼠140只，雄鼠20只。按雌、雄1∶1比例合籠，每日上午檢查托盤(pán)，發(fā)現(xiàn)陰栓取出編號(hào)，并連續(xù)2 d對(duì)大鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片檢查發(fā)現(xiàn)卵圓體即確定妊娠[2]。對(duì)造模成功的120例孕鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為瑞芬太尼組、電針三陰交加合谷組、電針夾脊穴組及空白對(duì)照組各30只。所有孕鼠在妊娠第19天開(kāi)始灌服蓖麻引產(chǎn)餐誘發(fā)大鼠啟動(dòng)產(chǎn)程[3]。

1.3 治療方法

1.3.1 空白對(duì)照組 自然分娩，未行任何處理。

1.3.2 電針夾脊穴組 大鼠產(chǎn)程啟動(dòng)至產(chǎn)下最后1個(gè)鼠仔期間，將大鼠固定在自制的木板上，在大鼠雙側(cè)L2、L4夾脊穴，相當(dāng)脊柱正中旁開(kāi)0.3 cm之處取穴[4], 直刺0.3寸左右,電針儀強(qiáng)度為0.1 mA，頻率2/100HZ交替疏密波，以能引起大鼠肢體輕微抖動(dòng)為針刺得氣，電針20 min，每隔2 h再電針1次，左右各1組，同側(cè)的L2、L4為1組。

1.3.3 電針三陰交加合谷組 在兩前肢第一、二掌骨之間取合谷穴直刺1 mm，在兩后肢內(nèi)踝尖直上10 mm處取三陰交穴直刺3 mm。兩穴接電針治療儀,頻率為2/100 Hz交替疏密波，強(qiáng)度0.1 mA，電壓9 V，波寬0.2～0.6 mS，左右各1組，同側(cè)的合谷、三陰交為1組。

1.3.4 瑞芬太尼組 孕鼠產(chǎn)程啟動(dòng)后， 尾靜脈持續(xù)泵注射鹽酸瑞芬太尼5 μg/kg/min，直至產(chǎn)下最后1個(gè)仔鼠為止[5]。

1.4 大鼠痛閾測(cè)定方法

熱水甩尾痛閾測(cè)定，各組大鼠在干預(yù)措施前后分別以(50±0.5)℃熱水浸燙鼠尾4 cm，記錄入水至甩尾出水的間隔時(shí)間(測(cè)量3次，取其均數(shù)，時(shí)間按秒計(jì)算[6])。

1.5 標(biāo)本采集方法

大鼠分娩結(jié)束后，按0.4 ml/100 g劑量10%的水合氯醛腹腔注射麻醉下斷頭處死，生理鹽水洗干凈，取大鼠大腦灰質(zhì)頂葉區(qū)、脊髓腰膨大段組織及子宮肌層組織，在-80 ℃冰箱標(biāo)號(hào)保存，3個(gè)月時(shí)間內(nèi)完成Western blot 及Real-time PCR檢測(cè)。

1.6 實(shí)驗(yàn)步驟

1.6.1 Western blot檢測(cè)大鼠中樞ERK通路信號(hào)分子C-Raf、 ERK-1、CREB蛋白及其磷酸化水平，靶器官ERK通路效應(yīng)分子Dyn蛋白表達(dá) 將大鼠大腦灰質(zhì)、脊髓腰椎膨大段及子宮肌層組織總蛋白提取，稱(chēng)取120 mg加入預(yù)冷500 μL細(xì)胞裂解液，裂解30 min，4℃ 12000 r/min離心20 min，蛋白定量。將蛋白上樣緩沖液稀釋?zhuān)? min置-80℃ 備用。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，至溴酚藍(lán)剛跑出分離膠時(shí)停止電泳(250 mA，90 min)轉(zhuǎn)膜， 5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，在室溫下振搖1～2 h，滴加一抗在封閉的膜內(nèi)，4℃過(guò)夜。次日PBS漂洗15 min，將膜用TBST清洗4次，每次5 min，再與二抗室溫下孵育1 h。TBST清洗后，將顯影劑滴加到PVDF膜正面，分析目標(biāo)蛋白灰度值采用凝膠圖像系統(tǒng)。Biovision公司提供BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，由CST公司提供的抗Raf、ERK、CREB，由Santa Cruz Biotechnology公司提供DYN抗體，由Thermo Fisher Scientific公司提供二抗及化學(xué)發(fā)光試劑盒，檢測(cè)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.2 Real-time PCR檢測(cè)大鼠中樞ERK通路信號(hào)分子C-Raf、 ERK-1、CREB及靶器官效應(yīng)分子Dyn 等mRNA表達(dá) 表1顯示，根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)用TRIzol試劑盒(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，California，USA)從速凍大鼠腦灰質(zhì)頂葉區(qū)、脊髓腰膨大段及子宮肌層提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩APDH為內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)。ABI Step One 型熒光定量PCR儀系統(tǒng)檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)量，相對(duì)基因表達(dá)量采用定量real-time PCR分析。反應(yīng)條件如下：起始階段，95 ℃，10 min；循環(huán)階段，變性，94 ℃，15 s，退火和延伸，72 ℃，10 s。擴(kuò)增反應(yīng)在ABI Step One detection system進(jìn)行，使用引物序列。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)4組大鼠行為學(xué)影響

表2顯示，方差分析結(jié)果顯示，4組大鼠治療前組間痛閾值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步LSD法多重比較顯示，與空白對(duì)照組比較，藥物鎮(zhèn)痛組、電針夾脊穴組與電針三陰交加合谷組痛閾值均明顯升高(P<0.01)，電針三陰交加合谷組與電針夾脊穴組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，痛閾值由高到低依次為藥物鎮(zhèn)痛組>電針三陰交加合谷組 /電針夾脊穴組>空白對(duì)照組。

表2 4組大鼠治療前后痛閾值比較

注：與治療前比較：**<0.01;與對(duì)照組比較:##P<0.01;與瑞芬太尼比較：&&P<0.01

2.2 MAPK/ERK通路信號(hào)分子mRNA在大鼠中樞及靶器官表達(dá)

表3顯示，ERK通路信號(hào)分子Raf-1、ERK-1、CREB mRNA在大腦灰質(zhì)組織細(xì)胞中表達(dá)組間無(wú)明顯差異性，而在脊髓膨大段組織細(xì)胞中表達(dá)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；進(jìn)一步LSD多重比較顯示，藥物組、電針夾脊穴組與電針三陰交加合谷組均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，電針夾脊穴組與電針三陰交加合谷組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Raf-1、ERK-1、CREB mRNA表達(dá)依次為：空白對(duì)照組>電針三陰交加合谷組/ 電針夾脊穴組>藥物鎮(zhèn)痛組。單因素方差分析各組大鼠子宮肌層組織細(xì)胞中效應(yīng)分子DYN mRNA表達(dá)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；LSD法兩兩比較顯示，藥物鎮(zhèn)痛組、電針夾脊穴組與電針三陰交加合谷組DYN mRNA表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，依次為藥物鎮(zhèn)痛組>電針三陰交加合谷組 /電針夾脊穴組>空白對(duì)照組。同樣電針三陰交加合谷組與電針夾脊穴組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 ERK通路信號(hào)分子及效應(yīng)分子mRNA在大鼠中樞及靶器官表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較：**P<0.01;與電針夾脊穴組比較:##P<0.01，#P<0.05;與電針三陰交加合谷組比較:&&P<0.01

2.3 MAPK/ERK通路信號(hào)分子及效應(yīng)分子蛋白在大鼠中樞及靶器官表達(dá)

表4圖1、2顯示，Western Blot檢測(cè)ERK信號(hào)分子及效應(yīng)分子蛋白在大鼠中樞及靶器官蛋白灰度值結(jié)果顯示，ERK通路信號(hào)分子C-Raf、ERK 1、P- ERK 1、CREB、P-CREB蛋白在大腦灰質(zhì)表達(dá)組間無(wú)明顯差異性， 脊髓膨大段組織細(xì)胞中組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；進(jìn)一步LSD多重比較顯示，藥物組、電針夾脊穴組與電針三陰交加合谷組均低于空白組(P<0.01)，C-Raf、ERK 1、P- ERK 1、CREB、P-CREB蛋白在組間表達(dá)依次為空白對(duì)照組>電針三陰交加合谷組/電針夾脊穴組 >藥物鎮(zhèn)痛組; 單因素方差分析各組大鼠子宮肌層組織細(xì)胞中DYN蛋白表達(dá)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；LSD法兩兩比較顯示，藥物鎮(zhèn)痛組、電針夾脊穴組與電針三陰交加合谷組DYN蛋白表達(dá)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，依次為藥物鎮(zhèn)痛組> 電針三陰交加合谷組/電針夾脊穴組>空白對(duì)照組，而電針三陰交加合谷組與電針夾脊穴組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 ERK通路信號(hào)分子及效應(yīng)分子蛋白及其磷酸化水平在大鼠中樞及靶器官表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較：**P<0.01;與電針夾脊穴組比較：##P<0.01，#P<0.05;與電針三陰交加合谷組比較：&&P<0.01

圖1 大鼠中樞ERK通路信號(hào)分子蛋白電泳圖

圖2 大鼠靶器官ERK通路效應(yīng)分子DYN蛋白電泳圖

3 討論

分娩鎮(zhèn)痛是現(xiàn)代文明的標(biāo)志，無(wú)副作用的鎮(zhèn)痛方法更是人們追求的目標(biāo)。針灸穴位鎮(zhèn)痛歷史悠久，由于操作方法簡(jiǎn)單、鎮(zhèn)痛效果明顯，無(wú)創(chuàng)傷且無(wú)副作用的優(yōu)勢(shì)而被臨床廣泛應(yīng)用，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制一直是人們研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。隨著對(duì)針刺鎮(zhèn)痛作用機(jī)制研究的不斷深入，對(duì)MAPK /ERK 信號(hào)通路，被應(yīng)激刺激激活調(diào)控疼痛的發(fā)生發(fā)展越來(lái)越受到學(xué)界的關(guān)注。

MAPK 信號(hào)通路廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，它通過(guò)高度保守的激酶、磷酸酯酶兩位點(diǎn)磷酸化和去磷酸化的聯(lián)級(jí)反應(yīng)，可以將胞外刺激信號(hào)信息傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[8-9]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulated protein kinase，ERK) 是 MAPK 家族依賴(lài)于 Ras途徑激活的一個(gè)蛋白激酶[10]，ERK 信號(hào)通路通過(guò)底物水平磷酸化而激活，屬于蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程[11]。絲/蘇氨酸蛋白激酶Raf是MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的第一個(gè)分子，啟動(dòng)三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)即MAPKKK-MAPKK (MKK)-MAPK[12]，MAPK通路中的分子開(kāi)關(guān)Ras介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)， Raf在活化的Ras作用下產(chǎn)生磷酸化而激活MEK，進(jìn)而激活ERK，被激活的ERK一方面在胞漿內(nèi)激活其他蛋白激酶，如RSK2或影響脊髓背角神經(jīng)元膜上離子通道Kv4.2及A-typek +電流(IA)，Kv4.2和IA在中樞敏化的神經(jīng)元興奮性中發(fā)揮著重要作用[13-14]。另一方面活化的ERK可從細(xì)胞漿易位到細(xì)胞核激活RSK2,使轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)在絲氨酸133上磷酸化, cAMP反應(yīng)元件(CRE) DNA與磷酸化的CREB結(jié)合在一起啟動(dòng)區(qū)域位點(diǎn)，從而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)位進(jìn)入磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB，調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)，如強(qiáng)啡肽、內(nèi)啡肽、c-fos、NK-1、神經(jīng)肽Y、促生長(zhǎng)激素及TrkB等，在痛覺(jué)敏化中發(fā)揮作用[15-16]。

強(qiáng)啡肽(dynorphin，DYN) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一個(gè)重要阿片肽，介導(dǎo)高強(qiáng)刺激鎮(zhèn)痛，且鎮(zhèn)痛作用部位主要在脊髓水平，脊髓水平的疼痛信息調(diào)控是在脊髓節(jié)段內(nèi)完成的，不依賴(lài)于脊髓與其以上腦結(jié)構(gòu)之間的完整聯(lián)系[17]。課題組在前期臨床中，對(duì)產(chǎn)婦在分娩時(shí)使用電針穴位發(fā)現(xiàn)能夠減輕分娩疼痛并能使產(chǎn)婦血清中強(qiáng)啡肽含量增加[18]。同時(shí)又對(duì)120例SD大鼠在分娩過(guò)程中應(yīng)用穴位電針并與藥物鎮(zhèn)痛組及空白組對(duì)照觀察，結(jié)果顯示，電針穴位可提高大鼠痛閾值，使血清dyn量升高及脊髓Pdyn、Oprk1 mRNA與蛋白表達(dá)水平升高[19]。Ji等發(fā)現(xiàn)，ERK的激活導(dǎo)致前強(qiáng)啡肽原mRNA和P物質(zhì)受體神經(jīng)激肽(NK-1)表達(dá)增加，從而增加佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠對(duì)熱傷害刺激和機(jī)械傷害刺激的痛敏[20]。電針可能通過(guò)對(duì)ERK1/2活化的抑制， 進(jìn)而抑制其下游致痛產(chǎn)物發(fā)揮即刻鎮(zhèn)痛效應(yīng)[21]。有文獻(xiàn)證實(shí)，神經(jīng)損傷后，ERK信號(hào)通路激活可引起下游CREB的表達(dá)增加，使用MEK抑制劑PD98059可以減少CREB的表達(dá)，從而減輕痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象[22]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針夾脊穴組及電針三陰交加合谷穴組均能有效提高分娩大鼠痛閾值，降低大鼠脊髓Raf/ERK/CREB蛋白與基因表達(dá)，并能進(jìn)一步抑制 ERK-CREB通路的磷酸化與增加DYN蛋白與基因表達(dá)。電針夾脊穴組與電針三陰交加合谷組比較，2電針組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在電針作用下，Raf/ERK/CREB蛋白表達(dá)及其磷酸化水平與DYN蛋白表達(dá)存在負(fù)反饋?zhàn)饔?，呈?fù)相關(guān)性關(guān)系。由此推測(cè)，電針對(duì)分娩鎮(zhèn)痛機(jī)制可能是通過(guò)抑制大鼠脊髓Raf/ERK/CREB通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)及降低其磷酸化水平，提高DYN蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果可以為電針?lè)置滏?zhèn)痛提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。