于明艷 耿雪 張乃斌 張冬梅 李玉杰 祝清芬 凌霄

(山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101)

妥布霉素屬于氨基糖苷類抗生素，能夠在細菌核糖體30S和50S亞基的聯(lián)結(jié)位置聯(lián)結(jié)，阻礙70S復合物的形成，使mRNA不能翻譯成蛋白質(zhì)，導致細菌死亡。主要對革蘭陰性菌，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、克雷伯菌、變形菌、檸檬酸桿菌有效。臨床主要用于結(jié)膜炎、角膜炎等眼部細菌感染，特別是對慶大霉素耐藥的革蘭陰性菌感染，如嚴重的銅綠假單胞菌感染有效[1-3]。

妥布霉素滴眼液于1981年3月15日由美國愛爾康公司研究上市，商品名“TOBREX”。其主要用于敏感細菌所致的外眼及附屬器的局部感染。不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為偶見局部刺激癥狀，不宜與其他腎毒性或耳毒性藥物合用或先后應(yīng)用[4-5]。國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)共31家，批準文號37個；國外在華注冊企業(yè)1家，進口批準文號1個，規(guī)格均為0.30%(3mg/mL)。按裝量標示，有5、8、9、10和0.4mL的包裝規(guī)格。目前僅中國藥典二部及美國藥典(USP)41收載妥布霉素滴眼液[1,6]。2018年國家評價性抽驗共抽取到174批次妥布霉素滴眼液，旨在客觀地評價國內(nèi)藥品的質(zhì)量現(xiàn)狀，分析產(chǎn)品的主要質(zhì)量問題，進而明確產(chǎn)品質(zhì)量提高的方向。本文依據(jù)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標準的檢驗結(jié)果結(jié)合探索性研究，對國內(nèi)市場上的妥布霉素滴眼液產(chǎn)品質(zhì)量進行了系統(tǒng)性分析研究，并提出對現(xiàn)行藥品標準改進的建議。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(DAD檢測器)；Q ExactiveTM超高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)；Agilent 7890氣相色譜儀-7697頂空進樣器；Mass Frontier 7.0軟件(Thermo Fisher Scieni fi c, MA, USA)；Mettler MS105DU電子天平；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Memmert公司)；高壓蒸汽滅菌器(日本Sanyo公司)；酶標儀(美谷生物)；MJ-250I霉菌培養(yǎng)箱；GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 試藥

妥布霉素對照品：批號：130527-200402，含量：91.4%，購自中國食品藥品檢定研究院；新酶胺對照品：批號：130411-200908，含量：100%，購自中國食品藥品檢定研究院；卡那霉素B對照品：批號：130548-200501，含量：100%，購自中國食品藥品檢定研究院；尼泊拉胺對照品：批號：10-RAJ-168-2，含量：95%(硫酸鹽形式)，購自Toronto Research Chemicals(TRC)；脫氧鏈酶胺卡那胺對照品(雜質(zhì)D、妥布霉素A)：批號：9-KPA-46-1，含量：97.95%，購自TRC；苯扎溴銨：批號：135051-201401，10.9mg/mL，購自中國食品藥品檢定研究院；苯扎氯銨：批號：1300549-201504，12.19mg/mL，購自中國食品藥品檢定研究院；羥苯乙酯：批號：100847-201604，含量：99.9%，購自中國食品藥品檢定研究院；羥苯丙酯：批號：100444-201403，含量：99.6%，購自中國食品藥品檢定研究院；硫柳汞鈉：批號：143172，含量：96.6%，購自Dr.Ehrenstorfer GmbH C 17515000；乙腈(Merck)、乙醇(科密歐)、二甲基亞砜(科密歐)、均為色譜純；三羥甲基氨基甲烷購自國藥，批號：20160907，含量≥99.0%；2,4-二硝基氟苯：購自Tokyo Chemical Industry(TCI)，批號：68XD2378，含量＞99.05%；DPBS緩沖液，批號：20180712，購自Hyclone公司；MTT，批號：MKBL3665V，購自Sigma-Aldrich公司；異丙醇，批號：20160928，購自天津市康科德技術(shù)有限公司；組織培養(yǎng)液B，批號：20180831，購自廣東博溪生物科技有限公司。Bio OcullarTMRHE三維角膜模型，批號：OT180803，購自廣東博溪生物科技有限公司

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104] 3-20180709-2、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003] 3-20180712-2、大腸埃希菌[CMCC(B)44102] 3-20180630-1、黑曲霉[CMCC(F)98003] 3-20180713-2；白念珠菌[CMCC(F)98001] 3-20180619-1，以上菌種購于中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學菌種保藏中心，工作菌種為第三代。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：172441)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：172401)均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉(批號：20171030)購于國藥集團化學試劑有限公司。

妥布霉素滴眼液174批次均為2018年國家計劃抽驗樣品，來源于21家生產(chǎn)企業(yè)。

2 試驗方法

2.1 法定檢驗

根據(jù)各廠家藥品批準文號信息，按2015年版中國藥典或國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(YBH02042016/YBH08652009/YBH17182006)進行法定檢驗。

2.2 探索性研究

根據(jù)法定檢驗結(jié)果，結(jié)合文獻檢索情況，圍繞著藥品安全性、有效性和質(zhì)量標準的可控性，進一步開展雜質(zhì)譜分析、有關(guān)物質(zhì)、抑菌劑眼刺激性、抑菌效力等項目的探索性研究。

2.2.1 雜質(zhì)譜分析

色譜條件：Agilent Zorbax S B-C18柱(4.6mm×250mm, 5μm)；流動相：10mmol/L三氟乙酸；柱溫：40℃；流速：0.5mL/min；進樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜采用加熱ESI源，正/負離子模式。加熱ESI離子源參數(shù)如下：

毛細管電壓：3200V(正負離子模式)噴霧電壓為3.0kV，毛細管溫度和霧化器分別為350和250℃。鞘氣和輔助氣分別設(shè)為275.58和103.4kPa, S-lens RF電壓為50V。噴霧氣和碰撞氣均為氮氣。掃描方式采用正離子Full MS/dd-MS2模式，此模式包含1次一級全掃描(分辨率70000FWHM)和1次數(shù)據(jù)依賴的二級掃描(分辨率17500FWHM)2個事件。一級全掃描范圍為m/z 100～1000，自動增益控制(AGC)和離子注入時間(IT)分別設(shè)為1.0e6和100ms；數(shù)據(jù)依賴的二級掃描(dd-MS2)AGC設(shè)為2.0e5，最大IT設(shè)為50ms，觀察窗(isolation window)設(shè)為1.0m/z，未充滿系數(shù)(underfill ratio)設(shè)為1.0%，強度閾(intensity threshold)設(shè)為4.0e4，同位素排除(exclude isotopes)設(shè)為“on”，動態(tài)排除(dynamic exclusion)設(shè)為10.0s;碰撞模式：高能量碰撞解離(HCD)；碰撞能量：NCE30，遞增率(Stepped)NCE 50%。

2.2.2 有關(guān)物質(zhì)測定

色譜條件：乙腈和三羥甲基氨基甲烷(簡稱Tris)溶液(取Tris2.0g加水溶解稀釋至800mL，加入1mol/L硫酸溶液20mL)作為流動相，進行梯度洗脫，見表1。流速：1.2mL/min；檢測波長：254nm；進樣量20μL分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

衍生化處理方法：量取待衍生溶液適量，置于50mL容量瓶中，加水2mL 2,4-二硝基氟苯溶液10mL、三羥甲氨基甲烷試溶液10mL，搖勻，蓋上塞子，置于60℃水浴中加熱50min，取出，加乙腈至離刻度約2cm處，冷卻至室溫，加乙腈至刻度，搖勻，即得。

表1 流動相梯度洗脫Tab.1 The gradient elution table of HPLC mobile phase

2.2.3 抑菌劑眼刺激性

采用3D角膜上皮模型來評價不同抑菌劑的眼刺激反應(yīng)。3D角膜上皮模型以人角膜上皮細胞為種子細胞，通過精細調(diào)節(jié)培養(yǎng)液成分，使細胞在體外分化形成3D角膜組織。具有與人角膜上皮高度相似的結(jié)構(gòu)與功能。該評價模型采用人源的角膜上皮模型與受試物相接觸，通過給藥后MTT細胞活性檢測方法測得模型ET50值，評估不同樣品的體外眼刺激性[7-8]。受試物采用的試驗濃度為表2所示。

2.2.4 抑菌效力考察

將21家企業(yè)的產(chǎn)品按照中國藥典2015版通則[1121]抑菌效力檢查法進行抑菌效力的考察。

3 結(jié)果及討論

3.1 法定檢驗

174批次妥布霉素滴眼液依據(jù)現(xiàn)行質(zhì)量標準檢驗，173批次符合規(guī)定，1批次檢查項羥苯乙酯不符合規(guī)定，合格率99.4%。該不合格批次產(chǎn)品生產(chǎn)日期為2017年4月。經(jīng)分析，其不合格原因為：(1)羥苯乙酯在堿性條件下不穩(wěn)定，該企業(yè)生產(chǎn)工藝中PH調(diào)節(jié)值高于大部分企業(yè)；(2)羥苯乙酯放置易降解，該不合格批次生產(chǎn)時間為2017年4月，屬于貨架末期產(chǎn)品；(3)經(jīng)調(diào)研其他企業(yè)多為高限投料，以保證貨架期產(chǎn)品羥苯乙酯檢查符合規(guī)定,該不合格批次生產(chǎn)企業(yè)羥苯乙酯投料量不能保證在效期內(nèi)降解后羥苯乙酯檢查合格。

表2 3D角膜上皮模型眼刺激性實驗給藥孵育時間設(shè)計Tab.2 Incubation time for eye stimulation experiment using human cornea-like epithelial tissue model

3.2 現(xiàn)行質(zhì)量標準發(fā)現(xiàn)的問題

本次評價的妥布霉素滴眼液不同生產(chǎn)企業(yè)添加的抑菌劑種類不同。添加的抑菌劑涉及苯扎氯銨、苯扎溴銨、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞鈉。其中硫柳汞鈉中含有汞，在人體中會有殘留富集作用，同時對眼表損傷較大，不建議作為抑菌劑在眼用制劑中使用。在標準檢驗中發(fā)現(xiàn)一家企業(yè)使用硫柳汞鈉作為抑菌劑。

現(xiàn)行質(zhì)量標準雜質(zhì)譜控制不全面。妥布霉素為發(fā)酵來源的抗生素，在發(fā)酵過程中易產(chǎn)生與其結(jié)構(gòu)類似的雜質(zhì)?，F(xiàn)行標準僅控制單個雜質(zhì)及其他各雜質(zhì)的和，對特定雜質(zhì)沒有控制，無法評價不同企業(yè)產(chǎn)品間的雜質(zhì)譜的不同，進而反映不同企業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量差異。

3.3 雜質(zhì)譜分析

采用Q-Exacive Plus高分辨液質(zhì)對不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品進行分析。發(fā)現(xiàn)各生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品雜質(zhì)譜TIC一致，獲得一級離子豐度較高的4個雜質(zhì)，其[M+H]+分別為324.1765、323.1925、484.2613和307.1976。采用MassFrontier軟件推測4個雜質(zhì)可能為脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺和卡那霉素B。本研究通過購買獲得了上述雜質(zhì)對照品，用Q-Exacive Plus高分辨液質(zhì)對雜質(zhì)對照品脫氧鏈霉胺卡那胺、新霉胺、卡那霉素B、尼泊拉胺進行分析。將雜質(zhì)對照品一級二級質(zhì)譜與妥布霉素滴眼液樣品中豐度較高的4個雜質(zhì)的一級二級質(zhì)譜進行對比，確認4個雜質(zhì)分別為脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺和卡那霉素B，雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及信息見表3。

表3 4種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息Tab.3 Structural informations of four impurities

3.4 有關(guān)物質(zhì)研究

參照進口注冊標準JX20100135色譜條件及柱前衍生的方法，采用的衍生化試劑為2,4-二硝基氟苯(DNFB)，在妥布霉素結(jié)構(gòu)中引入有紫外吸收的二硝基苯基基團，使妥布霉素及其雜質(zhì)具有紫外吸收，進而采用HPLC-UV的方法對其有關(guān)物質(zhì)進行檢查。將進口注冊標準JX20100135流動相條件由等度改成梯度洗脫，將經(jīng)高分辨液質(zhì)確認的4個雜質(zhì)制訂入標準。新建立的有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠?qū)⒏鱾€雜質(zhì)與主峰進行有效分離，同時排除輔料和抑菌劑對雜質(zhì)的干擾，特定雜質(zhì)的檢出由JX20100135的兩個(新霉胺、卡那霉素B)增加到4個(脫氧鏈霉胺卡那胺、尼泊拉胺、新霉胺、卡那霉素B)(圖1)。采用Gastrolplus公司ADMET predictor 9.0軟件對上述4個雜質(zhì)進行毒性預測。各雜質(zhì)對大鼠和小鼠均有致癌性，其中脫氧鏈霉胺卡那胺和新霉胺還具有肝毒性。

3.5 抑菌劑的眼刺激性

采用3D角膜上皮模型評價抑菌劑眼刺激性，與傳統(tǒng)的兔眼刺激法相比，該評價體系數(shù)據(jù)客觀、靈敏度高，能夠避免動物間的差異以及由動物外推至人的種屬差異性。應(yīng)用該模型評價妥布霉素滴眼液中抑菌劑的眼刺激性，通過抑菌劑ET50的比較(ET50越小，眼刺激性越大)，以孵育時間為橫坐標，組織活性值作為縱坐標作受試物溶液對組織活性影響作折線圖(圖2)。結(jié)果顯示羥苯乙酯、羥苯丙酯各處方濃度用量24h均未測到眼刺激性，硫柳汞鈉、苯扎氯銨、苯扎溴銨各處方濃度用量均表現(xiàn)出眼刺激性。具有刺激性的硫柳汞鈉、苯扎氯銨、苯扎溴銨在同一濃度(0.1mg/mL)下，刺激性程度依次為硫柳汞鈉＞苯扎氯銨(n-C12H25、n-C14H29取代)〉苯扎氯銨(n-C12H25取代)＞苯扎溴銨(圖3)。本次評價還發(fā)現(xiàn)n-C12H25、n-C14H29取代的苯扎氯銨刺激性大于n-C12H25取代的苯扎氯銨。在抑菌效力考察中，n-C12H25、n-C14H29取代的苯扎氯銨及n-C12H25取代的苯扎氯銨在同等的處方用量的情況下(0.1mg/mL)，對真菌和細菌的抑菌效力均能達到A級(表4)。建議滴眼劑中的苯扎氯銨使用刺激性較小的n-C12H25單體型苯扎氯銨。

3.6 抑菌效力的考察

圖1 系統(tǒng)適用性圖譜Fig.1 System suitability

圖2 抑菌劑對角膜組織活性的影響Fig.2 Effect of preservatives on corneal tissue activity

圖3 同一濃度(0.1mg/mL)下各抑菌劑刺激強度對比圖Fig.3 Contrast diagram of stimulus intensity of preservatives at the same concentration (0.1mg/mL)

妥布霉素滴眼液為抗生素類滴眼液，盡管抗生素有一定的抗菌作用，但是不同種類抗生素的抗菌譜不同，對抗菌譜以外的微生物起不到抑菌作用，因此多劑量眼用制劑應(yīng)選擇適當?shù)囊志鷦?，保證其在多次使用時不被微生物污染。本次評價對21家企業(yè)的妥布霉素滴眼液進行抑菌效力研究，其中3家企業(yè)的產(chǎn)品未達到中國藥典2015年版眼用制劑抑菌效力判斷標準。按照各企業(yè)抑菌劑使用情況，抑菌效力測定結(jié)果見表4。對各個廠家產(chǎn)品抑菌效力進行分析，排除處方中除抑菌劑以外其他輔料的干擾。由于妥布霉素屬氨基糖苷類抗生素，對細菌的抑制作用較強，未添加抑菌劑和使用羥苯乙酯(處方濃度0.1mg/mL)的妥布霉素滴眼液對真菌的抑菌效力較差，未達到中國藥典2015年版眼用制劑抑菌效力的要求。苯扎溴銨抑菌效力較好，處方濃度為0.05、0.1和0.2mg/mL時抑菌效力均能達到A級，根據(jù)中國藥典2015四部抑菌效力中抑菌劑使用應(yīng)是最低有效濃度的原則，部分企業(yè)使用的苯扎溴銨的濃度未使用最低有效濃度，存在過量添加的問題。

4 結(jié)論

本次評價性抽驗結(jié)果顯示，國產(chǎn)妥布霉素滴眼液總體質(zhì)量一般，產(chǎn)品合格率為99.4%。不合格項目為抑菌劑羥苯乙酯的檢查。

探索性研究揭示，目前國產(chǎn)妥布霉素滴眼液質(zhì)量標準仍有提高的空間，有關(guān)物質(zhì)、含量測定方法可做進一步修訂。該品種不同企業(yè)抑菌劑添加的情況也不同，建議加強對抑菌劑處方篩選的研究。抑菌劑對眼部均有不同程度的刺激性，過量使用抑菌劑，將會給臨床用藥帶來安全隱患。同時眼用制劑中某些抑菌劑由于自身穩(wěn)定性的原因，抑菌劑的濃度會隨時間而逐漸降低，達不到有效濃度，不能保證藥品使用的安全。因此，抑菌劑的合理使用和質(zhì)量控制是保證多劑量包裝眼用制劑安全性、有效性的關(guān)鍵。

表4 抑菌效力測定結(jié)果Tab.4 Test results of bacteriostatic efficacy