尋 陽，吳馥凌，崔蒙蒙，陳玫仰，李捷凱，劉 芳

（佛山科學技術學院口腔醫(yī)學院，廣東佛山528000）

趨化因子是一種能夠趨化細胞使其定向移動的細胞因子，與其相應受體結合能激發(fā)細胞內信號通路，引起一系列細胞微環(huán)境變化，廣泛參與機體的生理與病理過程，與炎癥反應、免疫防御等重要的機體功能密切相關［1］。

趨化因子受體是7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）。根據(jù)分子氨基端的半胱氨酸殘基排列順序的不同，趨化因子受體可分為CXCR，CCR，CR和CX3CR 4個亞型［2-3］。當與趨化因子配體結合時，通過受體胞內G蛋白結構變化，將胞外信息傳遞到胞內［4］，參與調控細胞的生長、分化、凋亡、組織損傷等各種病理和生理過程［5］，不同亞型的趨化因子受體在人體中扮演著不同角色。近年來，趨化因子受體在腫瘤中的角色受到諸多關注，如CCR7影響腫瘤細胞生長及向淋巴結的轉移［6］；CX3CR1在大腸癌中有表達且影響其轉歸［7］；CCL2/CCR2信號通路可參與CDb/Gr髓源細胞的數(shù)量變化，影響腫瘤負荷［8］；CCL20/CCR6影響喉癌細胞系及癌組織的增殖和轉移［9］等。為深入研究趨化因子受體在不同腫瘤中的作用，對其分子結構的破解意義重大。隨著2010年及2014年CXCR家族中CXCR1和CXCR4的結構問世及其相應靶向藥物的研發(fā)［10-11］，趨化因子受體的結構研究備受矚目。然而，由于受到其7次跨膜結構的影響，其表達相較于一般蛋白更具挑戰(zhàn)。常用于GPCR的生物表達系統(tǒng)為大腸桿菌表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)和昆蟲表達系統(tǒng)。本研究將針對這3種表達系統(tǒng)對趨化因子受體的表達方法進行綜述。

1 大腸桿菌表達系統(tǒng)

在異源表達蛋白的宿主中，大腸桿菌是最為常用的宿主。然而，作為跨膜型蛋白，趨化因子受體在大腸桿菌中表達時，由于表達系統(tǒng)差異性容易發(fā)生錯誤折疊亦或形成包涵體［12］。另一方面，外源膜蛋白的過量表達時常會導致細胞毒性［12］，降低細菌的生物量，從而減少目標蛋白的表達［13］。因此，在構建大腸桿菌表達系統(tǒng)時，常見的方法為使趨化因子受體以融合蛋白的形式進行表達。例如，硫氧還（thioredoxin）蛋白的融合蛋白能夠幫助重組趨化因子受體CCR5、CX3CR1等形成二硫鍵，以增加蛋白的穩(wěn)定性［14-15］，但其生物活性和表達量仍缺乏進一步研究。融合蛋白的使用在表達趨化因子受體外的GPCR中也十分常見，如利用GPCR-Gα融合蛋白表達孤兒G蛋白偶聯(lián)受體（oGPCR）［16］，毒蕈堿型乙酰膽堿受體(MACHR)M3-G11α融合蛋白用于研究偶聯(lián)受體M3等［17］。此外，提高膜蛋白的水溶性［18］可保證趨化因子受體的活性，如利用麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein（MBP））幫助膜蛋白正確折疊并使之嵌入細菌的細胞膜上［19-21］。2016年，CCR3以融合MBP生成MBP-CCR3的形式被成功表達［22］。

在大腸桿菌內表達趨化因子受體受到多種因素影響，如受體菌、培養(yǎng)基、誘導時機、表面活性劑等。在受體菌方面，篩選出能夠較好地表達外源蛋白并同時對蛋白過度表達產生的毒性有較大容忍性的細菌體至關重要。研究發(fā)現(xiàn)利用大腸桿菌TB1表達CCR3時的表達量明顯高于BL21和Top10［22］；利用BL21無法正常表達CCR5、CXCR4以及CX3CR1等受體［23］。除此之外，培養(yǎng)基的選擇也對趨化因子受體的表達［24］發(fā)揮重要作用。常用培養(yǎng)基包括LB、TB和2YT等。相較于LB和2YT，TB培養(yǎng)基含有更多的胰蛋白胨和酵母提取物，且具有較強的緩沖能力，可有效地穩(wěn)定培養(yǎng)基pH值。研究顯示，CCR3在TB培養(yǎng)基中表達量是在其他兩種培養(yǎng)基中表達量的10倍［22］。不僅如此，誘導時機對提高趨化因子受體在大腸桿菌內的表達亦十分關鍵。研究顯示，在可溶性GST-CRH在大腸桿菌表達中，OD600為0.8時為可溶性GST-CRH表達的最佳誘導時機［25］，低于或高于0.8值時表達量降低。對于有毒性的蛋白或膜蛋白的表達，較晚的誘導通?？梢缘玫捷^高的表達量，這是由于蛋白毒性可能抑制宿主菌生長、造成細菌密度降低［26］。表達 CCR3的最佳誘導時機為 OD600=0.6［22］，而表達 CCR5及 CXCR4時誘導值低于 0.6，可能說明CCR3對細菌的毒性小于CCR5和CXCR4［27］。最后，表面活性劑在趨化因子受體研究的后期純化、和結晶中扮演重要角色，篩選適合的表面活性劑除了具有增溶作用［28］還能保持目標蛋白的穩(wěn)定和溶液中的單體狀態(tài)［29-30］。

趨化因子受體在大腸桿菌內的表達需要精心設計，在菌種選擇、培養(yǎng)基選擇、誘導劑時機、表面活性劑條件上需要進行大量實驗摸索，篩選出最佳表達方案。然而，由于大腸桿菌是原核細胞表達系統(tǒng)，缺乏翻譯后修飾以及可能存在錯誤折疊等因素導致制備出的蛋白不具有生物學活性［31-32］，因此，時常需要運用其他的具備完整的表達系統(tǒng)，能夠完成整個蛋白表達過程的真核細胞表達體系。

2 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

選擇哺乳動物細胞表達系統(tǒng)能夠避免上述在大腸桿菌內出現(xiàn)的諸如蛋白結構錯誤、失去生物活性等問題。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)具有相對較完整的表達機制，能夠完成翻譯后的修飾，獲得空間結構完整的蛋白［33］。

利用哺乳動物系統(tǒng)表達趨化因子受體首先應確定誘導條件，包括誘導劑的選擇、誘導劑濃度、誘導時間等。常用于GPCR蛋白表達的誘導劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、四環(huán)素等。以趨化因子受體CCR3為例［22］，不加誘導劑時，幾乎不表達；加入2 μg/mL四環(huán)素和5 mmol丁酸鈉誘導48 h后表達量明顯提高；不僅如此，改變四環(huán)素和丁酸鈉的比例對CCR3的表達量亦有影響。其次，由于受到趨化因子受體跨膜結構的影響，蛋白在水溶液中容易聚集變性，需要表面活性劑的增溶。與大腸桿菌表達系統(tǒng)系統(tǒng)相似，合適的表面活性劑或其混合物能夠提高表達量和提取率，同時穩(wěn)定蛋白活性。不同的趨化因子受體有其對應的不同的表面活性劑，同一表面活性劑對不同趨化因子受體也有不同的影響。比如，Cymal 5能夠對趨化因子受體CCR5進行增溶和穩(wěn)定，但是對CXCR4的增溶效果不明顯［34-35］。因此，針對不同的趨化因子受體需要分別進行實驗探索，獲得最佳的表面化學劑實驗條件。

與大腸桿菌相比，哺乳動物細胞系能夠對表達出的趨化因子受體進行修飾，如對末端進行磷酸化、甲基化、糖基化等，形成完整的空間結構，實現(xiàn)蛋白質的正確折疊和功能有重要作用［36-38］。特別是對于趨化因子受體而言，七次跨膜的復雜結構在維持其特殊功能具有重要的作用，包括配體識別、信號傳導等一系列生物學反應。

3 昆蟲細胞表達系統(tǒng)

許多GPCR都是用桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)進行表達［39］，其表達水平高于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，且能對受體進行修飾。常用的昆蟲細胞系有Sf9和Sf21［40］。

利用昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達趨化因子受體時可以通過在培養(yǎng)基中添加不同趨化因子配體來影響受體的表達水平，例如，在Sf9系統(tǒng)中表達CXCR4以解析其分子結構時，為了穩(wěn)定CXCR4的結構，在表達系統(tǒng)中加入了配體CXCL12，CXCL12二聚體與CXCR4-N端連接［41］，另外，加入小分子拮抗劑IT1t和CVX15也可有效穩(wěn)定CXCR4的結構從而達到適用于蛋白結晶的表達量［42］；在Sf9系統(tǒng)中表達M2受體時，發(fā)現(xiàn)加入拮抗劑阿托品可增加蛋白的表達量，加入激動劑乙酰膽堿或哌侖西平則降低其表達量［40］；在構建昆蟲表達系統(tǒng)時，也常以融合蛋白的形式進行趨化因子受體表達，例如，在昆蟲表達系統(tǒng)中表達CXCR4時加入了T4 lysozyme融合蛋白以促進CXCR4晶體的生成［43-44］。

與哺乳動物相比，昆蟲細胞表達系統(tǒng)可高效表達受體，每升感染的細胞可表達1～500 mg的受體［45］，且更易研究GPCR的G-protein選擇性［46］，但受體在該系統(tǒng)中糖基化程度較低且形式單一［47］。

4 小結

綜上所述，趨化因子受體的表達重點在于保證趨化因子受體的結構穩(wěn)定前提下，提高其表達量，然而，作為含有7次跨膜疏水α螺旋結構的GPCR，除了制備過程比較困難外，同時還需要盡可能地保留其生物活性。因此，趨化因子受體的表達方法的研究存在一定難度。其表達是其解析分子結構的基礎。本文通過對趨化因子表達方法進行總結歸納，為相關基礎性研究提供參考依據(jù)。