夏宇成,張?zhí)m,陳宇潔,鞠建明,史艷玲
種子類藥材菟絲子為旋花科植物菟絲子(CuscutachinensisLam.)或南方菟絲子(CuscutaaustralisR.Br.)的干燥成熟種子,具有補(bǔ)益肝腎、固精縮尿、安胎、明目、止瀉的功效[1]309。菟絲子作為臨床上一種常用的中藥,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,在我國產(chǎn)地分布廣泛,主產(chǎn)于山東、河北、山西、陜西、江蘇、黑龍江、吉林、新疆等地,其化學(xué)成分主要包括黃酮類、多糖類、生物堿類、萜類、甾體類、揮發(fā)油以及木質(zhì)素等化合物[2],其中金絲桃苷、槲皮素、紫云英甙等黃酮類成分為其主要活性成分[3-4]。
圖1 金絲桃苷高效液相色譜圖:A為金絲桃苷對照品;B為供試樣品
菟絲子粒度細(xì)小,在實(shí)際煎煮過程中通常采用包煎的方式。但是課題組在研究其提取方法的時候發(fā)現(xiàn)該藥材包煎或不包煎,水提或醇提其主要活性成分金絲桃苷提取率均較低。分析原因,推測可能因?yàn)檩私z子種皮致密,提取溶劑不易滲透進(jìn)入種子內(nèi)部,有效成分難以提取出來。文獻(xiàn)報道菟絲子的提取方法有響應(yīng)面法提取多糖[5],正交試驗(yàn)酶法提取金絲桃苷[6],正交試驗(yàn)提取總黃酮[7]等方法,但均沒有考慮菟絲子種皮致密,溶劑不易穿透進(jìn)入的因素。鑒于王不留行、萊菔子等質(zhì)地類似的種子類藥材需要炒至爆開白花或炒至鼓起,用時搗碎的處理方法[1]53,272,本實(shí)驗(yàn)擬以金絲桃苷為評價指標(biāo),采用單因素平行比較法對菟絲子提取前處理方法進(jìn)行研究,確定搗碎是否有利于活性成分溶出,并對提取方式(包煎與否)和溶劑類型(水或乙醇)進(jìn)行比較研究;以正交設(shè)計法對溶劑濃度、溶劑倍數(shù)、提取次數(shù)、提取時間進(jìn)行優(yōu)選,確定最適宜工藝參數(shù)。
本研究起止時間為2016年6月至2017年6月。
Waters 2695高效液相色譜儀,美國Waters公司;Milli-Q純水儀,美國Millipore公司;Mettler AT210十萬分之一電子天平,瑞士METTLER公司;Legend Micro 21R離心機(jī),賽默飛世爾科技;電熱恒溫水浴鍋,江蘇省醫(yī)療器械廠;IKA RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,德國IKA公司;KQ-250E超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司。
甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑為分析純。金絲桃苷對照品(批號111521-201004),購自中國食品藥品檢定研究院。
菟絲子藥材(批號130501),購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司,產(chǎn)地內(nèi)蒙古,經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為旋花科植物南方菟絲子CuscutaaustralisR.Br.的干燥成熟種子。
2.1含量測定方法建立
2.1.1色譜條件[8]色譜柱Alltima C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85);流速1 mL/min;檢測波長360 nm;柱溫35 ℃。此條件下金絲桃苷與雜質(zhì)峰分離度大于1.5,分離良好,如圖1。
2.1.2對照品儲備液的制備 精密稱取金絲桃苷對照品7.2 mg,置于25 mL容量瓶中,加80%乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL含0.288 mg的對照品儲備液。
2.1.3供試品溶液的制備 精密量提取液15 mL,置圓底燒瓶中,減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑,精密加入20 mL 80%乙醇,密塞,超聲使充分溶解,離心,取上清液過0.45 μm的微孔濾膜,即得供試品溶液。
2.1.4線性范圍考察 取對照品儲備液5 mL,置10 mL容量瓶中,加入80%乙醇稀釋至刻度,依次稀釋成濃度為0.144,0.096,0.072,0.048,0.024,0.012 mg/mL的對照品溶液,依次吸取系列濃度對照品溶液20 μL,注入液相色譜儀,測定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行回歸分析,求得金絲桃苷回歸方程為:Y=3.34×106X-1.70×105(r=0.999 9),結(jié)果表明金絲桃苷在0.24~2.88 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.1.5精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為0.096 mg/mL的對照品溶液20 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,金絲桃苷峰面積的RSD(相對標(biāo)準(zhǔn)差)為1.1%,表明儀器精密度良好。
2.1.6重復(fù)性試驗(yàn) 同一樣品液按照2.1.3供試品制備方法制備6份供試品溶液,取20 μL注入液相色譜儀,計算得到金絲桃苷含量為0.044 mg/mL,RSD為2.8%。
2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,10 h進(jìn)樣測定,結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定,金絲桃苷含量的RSD為1.5%。
2.1.8加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品液7.5 mL,共6份,分別加入一定量的金絲桃苷對照品,按照2.1.3供試品制備方法制備供試品溶液,依法測定,結(jié)果回收率分別為98.0%,101.6%,99.9%,98.8%,101.3%,100.5%,平均加樣回收率為100.0%,RSD為0.7%。
2.2單因素試驗(yàn)考察菟絲子提取工藝根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),對影響菟絲子提取的主要因素提取前處理方法(搗碎與否)、提取方式(包煎與否)和提取溶劑類型(水或乙醇)分別進(jìn)行單因素比較,以確定適宜的提取工藝。
取菟絲子藥材20 g,精密稱定,按照表1各項(xiàng)加10倍量溶劑,加熱回流提取2次,每次1 h,抽濾,合并提取液,定容至500 mL,得提取液1~6號,按照2.1建立的方法測定金絲桃苷含量,結(jié)果見表1。
表1 單因素考察菟絲子提取方法
由表1可知,在藥材不搗碎的情況下,水提包煎金絲桃苷提取量比不包煎低38.0%,80%乙醇提包煎金絲桃苷提取量比不包煎低32.5%,包煎不利于有效成分的溶出,水提較醇提有利于有效成分的溶出;在藥材搗碎的情況下,不包煎醇提效果明顯優(yōu)于不包煎水提,而且不包煎醇提在所有平行比較實(shí)驗(yàn)中金絲桃苷提取量最高。綜合上述結(jié)果,筆者認(rèn)為菟絲子采用搗碎后不包煎醇提的方法有利于有效成分的提取。
2.3正交試驗(yàn)優(yōu)選菟絲子提取工藝參數(shù)
2.3.1正交試驗(yàn)供試品制備及測定 根據(jù)表1及平行實(shí)驗(yàn)確定的提取條件,對影響提取工藝的主要因素(A乙醇濃度、B溶劑體積、C提取時間、D提取次數(shù))按4因素3水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)[9]。各因素水平安排見表2。將菟絲子藥材搗碎,取20 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,分別按正交試驗(yàn)表中所列條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),平行2份,提取液抽濾,合并,根據(jù)實(shí)際得到的體積,適當(dāng)稀釋或濃縮,最終統(tǒng)一定容至500 mL,按照2.1建立的方法測定金絲桃苷含量,結(jié)果見表3。
表2 菟絲子提取正交試驗(yàn)因素水平
2.3.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對正交試驗(yàn)樣品含量測定結(jié)果,采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行直觀分析及方差分析,結(jié)果見表3,4。
表3 菟絲子提取正交試驗(yàn)安排及直觀分析
注:ki表示任意列上水平號為i時所對應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和;R為極差
表4 綜合評分方差分析
注:F0.05(2,2)=19,F(xiàn)0.01(2,2)=99,f均為2
由直觀分析可知,極差最大的為A因素,影響因素排序?yàn)锳>D>C>B。說明對金絲桃苷含量影響最大的為乙醇濃度,其次為提取次數(shù)、提取時間、溶劑倍數(shù),最優(yōu)提取工藝參數(shù)為A1D3C2B2;以B為誤差項(xiàng)對提取結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果A差異有統(tǒng)計學(xué)意義,C、D差異無統(tǒng)計學(xué)意義,從節(jié)約能源,提高生產(chǎn)效率角度考慮,綜合直觀分析和方差分析結(jié)果,確定最佳提取工藝為A1D2C2B2,即10倍量55%乙醇,提取2次,每次1 h。
2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行試驗(yàn),測定提取液中金絲桃苷含量,結(jié)果見表5。
表5 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)/%
由表5可見,確定的提取工藝金絲桃苷的平均含量為0.204%,RSD為1.7%,說明工藝重復(fù)性好,穩(wěn)定可行。
種子類藥材由于其種皮致密,傳統(tǒng)一般將其搗碎或炒至爆開白花,使溶劑能進(jìn)入種子內(nèi)部,有利于有效成分的溶出,然而菟絲子在臨床使用時一般用生品,未經(jīng)任何處理。本研究首次對菟絲子提取方法進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)菟絲子不搗碎時,不論是水提還是醇提,不包煎比包煎更有利于有效成分的溶出,可能是因?yàn)椴话遢私z子藥材分散在溶劑中,能充分接觸溶劑,而且在提取的過程中,菟絲子在微沸的溶劑中滾動,起到攪拌的作用;根據(jù)菟絲子中活性成分金絲桃苷的理化性質(zhì),醇提效果應(yīng)該優(yōu)于水提,然而在不搗碎時,醇提效果不如水提,可能是因?yàn)橐掖嫉臐B透性不如水,難以進(jìn)入菟絲子種子內(nèi)部,有效成分不利于提取出來,一旦菟絲子被搗碎破壁,乙醇就容易進(jìn)入其內(nèi)部,根據(jù)相似相溶原理,其醇提效果就優(yōu)于水提??傊?,本研究認(rèn)為菟絲子適宜的提取方法為先搗碎,然后采用乙醇提取,不宜包煎。該結(jié)論為同類種子類藥材的提取提供了較好的參考價值。
一般認(rèn)為,種子類藥材不包煎不利于提取液過濾,藥材搗碎破壁更加增加過濾的難度。但是我們對含菟絲子的臨床復(fù)方單副藥進(jìn)行煎煮,用100目濾網(wǎng)過濾,由于藥量較少,濾過比較容易,藥渣也能較好地濾除;工業(yè)生產(chǎn)中,隨著制藥設(shè)備的進(jìn)步,大量的藥液可以通過加壓使得提取液快速濾過,因此無論是臨床湯劑的單劑量煎煮,還是工業(yè)大生產(chǎn),種子類藥材搗碎破壁不包煎都是可行的。
本研究在確定提取方法后,采用正交試驗(yàn)法對醇提工藝參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化,確定了最適宜提取溶劑濃度、溶劑用量、提取時間和提取次數(shù),在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),確定制定的工藝重復(fù)性好,活性成分提取率高,適用于菟絲子的提取。