李麗

心搏驟停(cardiac arrest，CA)是臨床上最為常見的危重癥之一，是造成心臟猝死主要原因[1]。CA具有高致殘率、高病死率以及低復(fù)蘇成功率等特點，病情兇險，嚴重危害了我國居民的身體健康及生命安全[2]。心肺復(fù)蘇(CPR)是臨床治療CA的關(guān)鍵性搶救措施[3]，但目前臨床CA復(fù)蘇成功率仍很低。有效提高CA病人復(fù)蘇成功率，延長病人生存時間是目前臨床亟待解決的關(guān)鍵問題。本研究采用依達拉奉干預(yù)CPR后CA模型大鼠，取得良好效果，現(xiàn)作如下報告。

本研究起止時間為2014年1月至2016年2月。

1 材料與方法

1.1動物來源96只健康SD大鼠，體質(zhì)量范圍為220～260 g，購于北京華阜康科技有限公司。

1.2主要材料與儀器依達拉奉注射液(每支30 mg，生產(chǎn)批號：20140509)，購于西安利君制藥有限責(zé)任公司；ALC-V9動物呼吸機，購于北京吉安得爾科技有限公司；BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)，購于成都泰盟科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒，購于長沙賽晶生物科技有限公司；Trizol、DEPC、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit，購于日本TaKaRa公司；DNA Marker，購于天根生化科技有限公司；Real-Time PCR儀ABI7500，購于美國ABI公司；水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)、AQP9、β-action PCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1模型建立及分組處理 將大鼠采用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(28例)，依達拉奉組(34例)、生理鹽水組(34例)，依達拉奉組及生理鹽水組采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，氣管插管備接呼吸機，動、靜脈置管，待大鼠血流動力學(xué)穩(wěn)定后，經(jīng)食道采用快速起搏法誘導(dǎo)CA。CA造模成功5 min后，開始實施CPR，待自主循環(huán)恢復(fù)后，依達拉奉組立即靜脈注射3 mg/mL依達拉奉，生理鹽水組給予等體積生理鹽水，假手術(shù)組不誘導(dǎo)CA模型，僅進行動、靜脈置管及氣管插管。連續(xù)監(jiān)測三組心電圖及血流動力學(xué)1 h后縫合傷口，待依達拉奉組和生理鹽水組中所有大鼠造模蘇醒后拔除插管，放入籠中常規(guī)飼養(yǎng)。

CA造模成功標準：動脈搏動波消失，并且平均動脈壓<10 mmHg，心電圖顯示無脈性電活動或心室顫動呈一條直線。

自助循環(huán)恢復(fù)標準：心電圖顯示出現(xiàn)包括房性、竇性或者交界性室上性節(jié)律，平均動脈壓>20 mmHg，并持續(xù)超過5 min。

1.3.2觀察指標 分別于自主循環(huán)恢復(fù)后12、24、48、72 h，觀察以下指標：(1)測定三組大鼠各個時間點心肌組織中SOD、MDA水平，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明進行；(2)光學(xué)顯微鏡下觀察三組不同時間點心肌病理學(xué)變化；(3)測定三組不同時間點腦組織含水量，腦組織含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%；(4)采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測三組不同時間點腦組織AQP4、AQP9 mRNA水平。

1.3.3RT-PCR檢測AQP4、AQP9 mRNA水平 自主循環(huán)恢復(fù)后12、24、48、72 h后處死大鼠，采用Trizol抽提法提取腦組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用作RT-PCR檢測AQP4、AQP9 mRNA水平的模板。設(shè)計好的AQP4、AQP9以及內(nèi)參β-action引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

反應(yīng)條件：92 ℃預(yù)變性4 min；92 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，重復(fù)30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀掃描成像。凝膠成像儀對電泳圖像進行分析處理后，以AQP4、AQP9 mRNA光密度值占β-action mRNA光密度值百分比為AQP4、AQP9 mRNA相對含量。公式：AQP4相對含量=(AQP4 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%，AQP9 mRNA光密度值=(AQP9 mRNA光密度值/β-action mRNA光密度值)×100%。

2 結(jié)果

2.1三組大鼠處理前基礎(chǔ)參數(shù)比較三組大鼠體質(zhì)量、平均動脈壓、舒張壓、收縮壓及心率等基礎(chǔ)參數(shù)比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。具體結(jié)果見表2。

2.2三組大鼠心肌組織SOD、MDA水平比較12、24、48、72 h處死大鼠，假手術(shù)組心肌組織中SOD水平均明顯高于依達拉奉組、生理鹽水組(P<0.05)，MDA水平明顯低于依達拉奉組及生理鹽水組(P<0.05)，依達拉奉組心肌組織中SOD水平均明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，MDA水平明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。結(jié)果見表3,4。

2.3三組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較光學(xué)顯微鏡下觀察三組大鼠不同時間點心肌組織病理形態(tài)可見，12 h處死大鼠，假手術(shù)組大鼠心肌纖維互聯(lián)成網(wǎng)，排列整齊，細胞核染色均勻，細胞間隙正常，閏盤清晰染色較深；依達拉奉組可見心肌組織存在散在片狀壞死灶，心肌細胞間隙增大，核染色變淺；生理鹽水組心肌組織彌漫性壞死，較之依達拉奉組更甚。24、48 h處死大鼠，生理鹽水組心肌組織壞死程度及范圍均明顯較依達拉奉組嚴重，壞死心肌纖維排列松散紊亂，核染色較淡甚至消失。72 h處死大鼠，生理鹽水組心肌壞死程度明顯高于依達拉奉組，心肌纖維斷裂，細胞核稀疏。見圖1。

表1 AQP4、AQP9 及內(nèi)參β-action引物序列

表2 三組大鼠處理前基礎(chǔ)參數(shù)比較結(jié)果

表3 三組大鼠SOD水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

2.4三組大鼠腦組織含水量比較12、24、48、72 h處死大鼠，生理鹽水組腦組織含水量均明顯高于依達拉奉組、假手術(shù)組(P<0.05)，且假手術(shù)組與依達拉奉組腦組織含水量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表5。

2.5三組大鼠AQP4、AQP9mRNA水平12、24、48、72 h處死大鼠，依達拉奉組AQP4、AQP9 mRNA水平均明顯低于生理鹽水組(P<0.05)。具體結(jié)果見表6,7。

3 討論

CA發(fā)生時，心臟失去正常泵血功能導(dǎo)致機體組織器官因缺氧缺血而發(fā)生損傷，隨著CA時間延長，組織損傷愈嚴重。及時實施CPR有望逆轉(zhuǎn)CA過程，但目前臨床CA復(fù)蘇成功率以及病人遠期生存質(zhì)量仍然不佳。相關(guān)資料顯示[4]，北美洲每年大約有50萬人接受CPR，但僅有20%～50%病人自主循環(huán)恢復(fù)，且仍有許多病人在自主循環(huán)恢復(fù)后死亡。CA復(fù)蘇成功率低與組織器官缺氧缺血時間長短以及繼發(fā)缺血性再灌注密切相關(guān)[5]。研究表明[6]，氧自由基在組織缺血再灌注損傷過程中起重要作用。依達拉奉具有有效清除氧自由基的作用而被廣泛應(yīng)用于臨床腦卒中治療方面[7-8]，但其在CA后CPR過程中是否具有保護作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在探討依達拉奉干預(yù)CPR后CA模型大鼠對心肌組織及腦組織的保護作用，試圖為依達拉奉應(yīng)用于臨床CA治療提供一定理論依據(jù)。

表4 三組大鼠MDA水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表5 三組大鼠腦組織含水量比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表6 三組大鼠AQP4 mRNA水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

表7 三組大鼠AQP9 mRNA水平比較結(jié)果

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與生理鹽水組比較，bP<0.05

SOD是機體超氧陰離子清除劑，其活性水平可有效反映清除機體氧自由基能力及抗氧化應(yīng)激能力，MDA是機體氧自由基攻擊不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質(zhì)過氧化的標志性產(chǎn)物[9]，其表達水平可間接反映機體受到氧自由基攻擊嚴重程度。依達拉奉具有較強親脂性，是機體自由基的捕獲劑，可快速到達組織降低羥自由基水平，發(fā)揮強大抗氧化作用[10-11]。本研究結(jié)果表明，12、24、48、72 h處死大鼠，假手術(shù)組心肌組織中SOD水平均明顯高于依達拉奉組、生理鹽水組，MDA水平明顯低于依達拉奉組及生理鹽水組，依達拉奉組心肌組織中SOD水平均明顯高于生理鹽水組，MDA水平明顯低于生理鹽水組，提示依達拉奉可有效清除機體氧自由基，從而減少MDA生成，減少SOD消耗，從而起到減輕心肌組織氧化應(yīng)激損傷作用；病理學(xué)觀察結(jié)果可見，各時間點生理鹽水組心肌病理學(xué)損傷程度均高于依達拉奉組，說明依達拉奉干預(yù)CA后CPR模型大鼠可減輕心肌組織損傷，起到有效心肌保護作用；CA后實施CPR的最終目的是盡可能保護及恢復(fù)病人完整腦功能，依達拉奉具有分子量很小，水溶性及脂溶性特點，因此十分容易穿透機體血腦屏障，在腦組織中發(fā)揮強大神經(jīng)保護作用。AQP4是一類主要分布于軟腦膜、腦室管膜的通道蛋白，是腦膠質(zhì)細胞與血管及腦脊液間水分轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[12]。研究表明[13]，AQP4在腦出血后大量自由基導(dǎo)致腦水腫形成過程中扮演重要角色，AQP4可能與自由基之間存在著某種聯(lián)系。目前，AQP4已成為腦水腫形成研究的重要熱點。研究表明[14-15]，腦組織AQP9過度表達與機體腦水腫形成同樣存在密切關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，12、24、48、72 h處死大鼠，依達拉奉組腦組織含水量均明顯低于生理鹽水組，依達拉奉組AQP4、AQP9 mRNA水平均明顯低于生理鹽水組，由此可見，依達拉奉可有效減輕CA后實施CPR腦水腫，且對AQP4、AQP9 mRNA表達具有下調(diào)作用，因此筆者推測，依達拉奉減輕大鼠腦水腫的作用機制為下調(diào)了腦組織中AQP4、AQP9基因的表達。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，依達拉奉可減輕CA大鼠CPR后心肌損傷，可通過下調(diào)AQP4、AQP9表達減輕大鼠腦水腫，由于CA發(fā)病機制復(fù)雜，依達拉奉具體通過哪些信號通路發(fā)揮治療作用，有待更進一步深入研究。

(本文圖1見插圖4-2)