楊冬梅，程 福，王 潔，楊 倩，楊 莉，黃遠(yuǎn)帥

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科，四川瀘州 646000)

許多患者在輸注充足劑量的血小板后，其未見(jiàn)有效地提升，有時(shí)甚至下降，臨床出血未明顯的改善，此為血小板輸注無(wú)效(platelet transfusion refractoriness,PTR)[1]。PTR的原因基本可歸結(jié)為非免疫因素和免疫因素[2-4],非免疫因素主要是感染、發(fā)燒、脾功能亢進(jìn)素，免疫因素為患者體內(nèi)產(chǎn)生抗人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)和抗人血小板抗原(human platelet antigen，HPA)的抗體。據(jù)相關(guān)報(bào)道[5]，引起PTR的血小板同種抗體中80%為HLA抗體。針對(duì)產(chǎn)生HLA抗體的患者，最佳的方法是輸注HLA相合的血小板[5]。但是在實(shí)際的臨床工作中，常常難以獲得和患者HLA相合的血小板。

早在20世紀(jì)80年代，不少研究報(bào)道檸檬酸可以處理血小板表面HLA-Ⅰ抗原[6-7]。近期又有學(xué)者提出[8-10]，pH=3的檸檬酸可以洗脫血小板表面的HLA-Ⅰ抗原，但是關(guān)于洗脫效率、對(duì)血小板功能的影響及洗脫的條件，不同的研究有所不同。本研究探討檸檬酸洗脫血小板表面HLA-Ⅰ類抗原的效率和對(duì)血小板功能的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 所有的血小板均來(lái)自四川省瀘州市中心血站。獻(xiàn)血者符合國(guó)家規(guī)定的獻(xiàn)血者標(biāo)準(zhǔn)，均為提前1 d準(zhǔn)備的新鮮血小板。每次實(shí)驗(yàn)前，用血球分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，驗(yàn)證其白細(xì)胞殘留量、紅細(xì)胞殘留量、血小板數(shù)分別達(dá)到國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中性別、年齡、血小板計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要儀器與試劑 流式細(xì)胞分析儀(FACSCANTO Ⅱ,美國(guó)BD公司)；722分光光度計(jì)(棱光，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造)；光學(xué)顯微鏡(BX50,日本Olympus公司)；血細(xì)胞分析儀(BC-6800，美國(guó)Mindray公司)；血小板恒溫振蕩保存箱(山江電子科技)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)池(上海市求精生化試劑儀器有限公司)；藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人CD62P抗體(批號(hào):555749，美國(guó)BD公司)；異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的鼠抗人HLA-ABC抗體(批號(hào):555748，美國(guó)BD公司)；FITC標(biāo)記的鼠抗人IgG1同型對(duì)照抗體(批號(hào):555742，美國(guó)BD公司)，PE標(biāo)記的鼠抗人IgG1同型對(duì)照抗體(批號(hào):555749，美國(guó)BD公司)；含1%胎牛血清清蛋白(BSA)的pH=3的檸檬酸緩沖液；PBS緩沖液。

1.3方法

1.3.1檸檬酸緩沖液的配制 pH=3的檸檬酸緩沖液由等體積的0.263 mol/L檸檬酸和0.123 mol/L Na2HPO4配制而成，其中含1% BSA，pH計(jì)滴定微調(diào)，置于50 mL的無(wú)菌容器備用。

1.3.2酸處理血小板 按照析因設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)條件。反應(yīng)時(shí)間3個(gè)水平(5、10、15 min)，檸檬酸與標(biāo)本的體積比(V1∶V2)5個(gè)水平(5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1),每種組合重復(fù)2次。參考文獻(xiàn)[8，11]的方法進(jìn)行了部分改進(jìn)。取500 μL濃縮血小板懸液(約含5×108個(gè)血小板)于試管中，離心 (10 min,1 500 g)，棄上清液，加入一定量的酸溶液，置于冰上0 ℃反應(yīng)一定的時(shí)間。加入過(guò)量PBS中止反應(yīng)，然后立即離心(10 min,1 500 g)洗滌血小板，最后將其重懸于乏血小板血漿(platelet poor plasma,PPP)。

1.3.3血小板質(zhì)量與功能的改變 析因設(shè)計(jì)選擇的最佳實(shí)驗(yàn)條件處理血小板作為試驗(yàn)組，用PBS代替檸檬酸處理血小板作為對(duì)照，未處理為空白對(duì)照，進(jìn)行如下質(zhì)量與功能的檢測(cè)。(1)血細(xì)胞分析儀上檢測(cè)各組血小板計(jì)數(shù)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)。(2)取處理后的血小板10 μL于牛鮑計(jì)數(shù)板沖池，觀察是否有大血小板及是否有聚集，同時(shí)革蘭染色鏡檢。(3)使用722分光光度計(jì)，參考血小板聚集儀的檢測(cè)原理[12]，檢測(cè)血小板的低滲休克反應(yīng)(HSR)，記錄樣本透光率的變化。樣本最大透光率記錄為TMAX，透光率平衡后的最小樣本透光率記錄為TMIN；另一測(cè)試杯中加入PBS，記錄為TPBS。HSR=(TMAX-TMIN)/(TMAX-TPBS)×100%。

1.3.4檢測(cè)血小板表面HLA-Ⅰ抗原及CD62P抗原 根據(jù)前向散射角(FCS) 和側(cè)向散射角(SSC) 確定待檢細(xì)胞群，確定血小板的檢測(cè)范圍。檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)的變化。取血小板100 μL(約含血小板1×106個(gè))置于試管中，加入PE標(biāo)記的CD62P抗體、FITC標(biāo)記的HLA-Ⅰ抗體各20 μL，同型對(duì)照管加入PE、FITC標(biāo)記的鼠抗人IgG各20 μL，室溫閉光孵育30 min，加入400 μL PBS，上機(jī)檢測(cè)各組血小板表面HLA-Ⅰ抗原和CD62P抗原。

2 結(jié) 果

2.1析因設(shè)計(jì) 反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)并不會(huì)提高HLA-Ⅰ類抗原的洗脫效率(P>0.05)，檸檬酸與血小板體積比為5∶1時(shí)才能有效洗脫血小板表面的HLA-Ⅰ類抗原(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同反應(yīng)條件血小板表面HLA-Ⅰ抗原表達(dá)率

2.2血小板常規(guī)質(zhì)量指標(biāo) 3組血小板數(shù)量上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PBS和酸處理后的血小板MPV、PDW均高于未處理組(P<0.01)，酸處理組變化更明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組血小板常規(guī)質(zhì)量指標(biāo)比較

2.3血小板形態(tài) 顯微鏡下見(jiàn)牛鮑計(jì)數(shù)板中的各組血小板散在分布，未見(jiàn)明顯聚集。酸處理的血小板體積稍有增大，染色稍深，見(jiàn)圖2。

A：未處理組；B：PBS處理組；C：酸處理組

圖2各組血小板涂片革蘭染色

2.4HLA-Ⅰ類抗原及CD62P抗原的表達(dá) 與未處理組比較，酸處理組HLA-Ⅰ表達(dá)率從(88.86±4.37)%降至(12.44±11.91)%(P<0.01)，而CD62P的表達(dá)率從(4.17±3.54)%增至(8.88±5.70)% (P>0.05)，見(jiàn)圖3。

A：各組HLA-Ⅰ類抗原表達(dá)率；B：各組CD62P的表達(dá)率；C：流式細(xì)胞圖；*：P<0.05

圖3 HLA-Ⅰ類抗原及CD62P抗原的表達(dá)

2.5血小板HSR 酸處理組HSR(51.65±6.56)%較未處理組(62.05±8.14)%降低(P<0.01)，與PBS處理組(54.95±6.32)%相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 各組血小板HSR情況

3 討 論

PTR目前仍然是臨床上一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題，而HLA-Ⅰ類抗原是引起免疫相關(guān)的PTR的主要原因[13]。雖然最佳的做法是輸注HLA相配合的血小板，但是由于HLA分型成本高且費(fèi)時(shí)[14]，目前還沒(méi)有建立一個(gè)完整的HLA分型庫(kù)，對(duì)HLA-Ⅰ類抗原引起的PTR，研究一種新的方法作為其緊急輸血策略，完善臨床輸血非常重要。本試驗(yàn)一方面評(píng)估檸檬酸能否有效處理血小板表面的HLA-Ⅰ類抗原，另一方面通過(guò)評(píng)估該處理技術(shù)是否引起血小板形態(tài)及功能的改變，驗(yàn)證該技術(shù)的可行性。

按照析因設(shè)計(jì)的原理和方法，對(duì)影響試驗(yàn)結(jié)果的各個(gè)因素進(jìn)行多水平重組分析，檢測(cè)HLA-Ⅰ類抗原表達(dá)率的變化，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間并不會(huì)影響血小板表面抗原的表達(dá)率，而只有在V1∶V2為5∶1的時(shí)候，檸檬酸洗脫血小板表面HLA-Ⅰ類抗原的效率最大。故考慮pH=3，反應(yīng)時(shí)間5 min，反應(yīng)體積5∶1為最佳試驗(yàn)條件，以此作為試驗(yàn)組的反應(yīng)條件。

本研究顯示檸檬酸能有效洗脫血小板表面的抗原，與近期的研究結(jié)果一致[8，15]。CD62P是血小板活化的重要標(biāo)志物之一，既往研究[11]提示血小板在酸處理后活化明顯增高。但在本研究中，血小板CD62P的表達(dá)只是稍有增高，推測(cè)既往的高活化水平一方面是試驗(yàn)的標(biāo)本不是新鮮血小板，自身活化偏高，另一方面是酸作用的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及終止反應(yīng)不徹底。因?yàn)镠OLME[16]的研究表明，當(dāng)血小板pH值較低時(shí)，血小板的形態(tài)和功能將出現(xiàn)不可逆的損傷。

通過(guò)對(duì)血小板常規(guī)指標(biāo)的分析，發(fā)現(xiàn)3組血小板計(jì)數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，酸處理組和PBS處理組MPV和PDW均高于未處理組(P<0.05)，推測(cè)離心、洗滌等一系列操作步驟和檸檬酸的共同作用導(dǎo)致MPV和PDW的改變。鏡下觀察酸處理的血小板，體積稍有增大，染色較深，但沒(méi)有聚集現(xiàn)象。MPV和PDW的改變提示血小板質(zhì)量的下降和存儲(chǔ)損傷[17-18]，而血小板形態(tài)的改變，可能會(huì)縮短血小板體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，進(jìn)而影響血小板的回收率和存活率。

HSR是血小板在低滲環(huán)境中體積膨脹之后，再恢復(fù)其正常體積的能力，反映血小板的體外功能及質(zhì)量，是反映血小板回收率和存活率較好的指標(biāo)[19]。與血小板形態(tài)的改變結(jié)果一致，酸處理后的HSR低于未處理組(P<0.05)。說(shuō)明酸處理會(huì)影響血小板的質(zhì)量，但與文獻(xiàn)[20]相比較，HSR值不算太低，故考慮酸處理后的血小板仍有應(yīng)用于臨床的價(jià)值。

綜上所述，酸處理能有效洗脫血小板表面的HLA-Ⅰ類抗原，洗脫率高達(dá)80%，血小板活化增加，MPV、PDW稍增高，HSR值降低，所以筆者認(rèn)為酸洗脫血小板這一技術(shù)對(duì)血小板質(zhì)量的影響尚可接受，針對(duì)HLA-Ⅰ類抗原引起的PTR，有望將酸洗脫血小板作為其緊急輸血的備選方案之一。今后的試驗(yàn)，一方面需要繼續(xù)優(yōu)化和改進(jìn)酸處理這項(xiàng)技術(shù)，減少?gòu)?fù)溫、離心、振蕩等操作對(duì)血小板的損傷，建議操作步驟盡量流暢，不要室外放置過(guò)久。另一方面，補(bǔ)充相關(guān)試驗(yàn)，完善對(duì)血小板聚集、分泌、黏附、釋放、代謝功能的研究，全面評(píng)價(jià)該技術(shù)的臨床可行性、有效性、切實(shí)性，為臨床提供切實(shí)可靠的依據(jù)。