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        結(jié)腸癌干細(xì)胞在結(jié)腸癌組織的表達(dá)及其對(duì)腫瘤線(xiàn)粒體呼吸鏈的影響

        2019-03-27 08:47:04余少鴻趙永恒李建昌宋登輝高俊勇
        重慶醫(yī)學(xué) 2019年6期
        關(guān)鍵詞:復(fù)合物結(jié)腸癌線(xiàn)粒體

        余少鴻,趙永恒,朱 磊,羅 然,楊 杰,舒 杰,李建昌,宋登輝,高俊勇

        (1.云南省昆明市第一人民醫(yī)院甘美國(guó)際醫(yī)院普外科 650000;2.重慶市涪陵中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 400800)

        結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤之一[1],雖然有手術(shù)、化療、分子靶向治療等綜合治療手段,但療效不佳。腫瘤干細(xì)胞理論是近年來(lái)提出的新理論[2],可能更好解釋腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞存在于白血病、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤。2007年首次報(bào)道結(jié)直腸癌干細(xì)胞的存在[3-5],其具有自我更新、多向分化、能連續(xù)傳代等特征。其鑒定的方法主要是流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物CD133、CD44、乙醛脫氫酶1(ALDH1)、上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhension molecule,EpCAM)、CD166等。CD44是一種與細(xì)胞增殖、腫瘤侵入、血管增生相關(guān)的膜受體,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,拮抗CD44可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

        分離培養(yǎng)腫瘤干細(xì)胞是研究結(jié)腸癌干細(xì)胞的前提,國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道,從結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞提取CD44/EpCAM陽(yáng)性細(xì)胞可以達(dá)到17.4%[6]。因此,筆者擬采用新鮮結(jié)腸癌及結(jié)腸癌細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)腸癌干細(xì)胞,并建立穩(wěn)定傳代的結(jié)腸癌干細(xì)胞珠。線(xiàn)粒體是細(xì)胞能量生成、儲(chǔ)存和供給的場(chǎng)所,電子在線(xiàn)粒體內(nèi)沿電子傳遞鏈經(jīng)氧化磷酸化的方式被轉(zhuǎn)化成含有高能磷酸鍵的腺苷三磷酸(ATP),線(xiàn)粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ~Ⅳ是電子傳遞鏈的組成成分,其活性變化能直接或間接地反映線(xiàn)粒體呼吸功能的變化。復(fù)合物Ⅰ是呼吸酶復(fù)合物中最大的一個(gè),高能電子首先經(jīng)過(guò)復(fù)合物Ⅰ,釋放能量后依次下傳。復(fù)合物Ⅲ細(xì)胞色素C氧化酶(COX)是位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜上呼吸鏈末端的限速酶,是唯一能將電子傳遞給氧分子的細(xì)胞色素復(fù)合物,因此復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ在整個(gè)電子傳遞及氧化磷酸化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。本研究探索人結(jié)腸癌干細(xì)胞COXⅠ、ND1基因mRNA的表達(dá)變化。

        1 材料與方法

        1.1材料 新鮮結(jié)腸癌組織選自本院37例結(jié)腸癌手術(shù)患者標(biāo)本;人結(jié)腸癌HCT-116、HT-29細(xì)胞均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明生物研究所惠贈(zèng);CD44抗體及CD133抗體均購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司,Actin抗體、細(xì)胞裂解液(RIPA)均購(gòu)自碧云天公司(中國(guó)),10%胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Biological Industries公司,Dulbecco改良細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司,流式細(xì)胞儀Accuri C6購(gòu)自美國(guó)BD公司。

        1.2方法

        1.2.1新鮮結(jié)腸癌細(xì)胞的分離 選取結(jié)腸癌患者新鮮病理標(biāo)本,剪碎標(biāo)本,離心,DTT液去除黏膜,PBS液沖洗4次,DNA裂解酶分離裂解標(biāo)本,PBS液洗滌,DNA酶拮抗劑中和,磨碎標(biāo)本,離心,提取結(jié)腸癌細(xì)胞。

        1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與分離 將結(jié)腸癌細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),常規(guī)傳代。CD44磁珠與人新鮮結(jié)腸癌細(xì)胞、HT29細(xì)胞和 HCT116細(xì)胞孵育,然后用LS柱(Miltenyi Biotec,130042401)與磁珠分選起始套裝(Miltenyi Biotec,130091051)混合分離CD44+細(xì)胞;CD44+/-細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12 培養(yǎng)液(Gibico,1237830),包括cEGF、bEGF和B27等因子。而沒(méi)有分離的細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液(HyClone,SH30243.01B)。每隔3 d顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

        1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面標(biāo)記物 收集結(jié)腸癌細(xì)胞后,把每管0.5 mol/L細(xì)胞,離心,取沉淀,混勻,添加抗體IgG1-PE、IgG1-FITC、CD133-PE和CD44-FITC(各2 μL/0.5 mol/L)在2~8 ℃孵育。CD133或CD44陽(yáng)性細(xì)胞由流式細(xì)胞儀Accuri C6篩選。重懸細(xì)胞于培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.2.4細(xì)胞總RNA的提取和鑒定 結(jié)腸癌干細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)8 h,以同期培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞株為對(duì)照,提取細(xì)胞總RNA。首先用PBS緩沖液將細(xì)胞清洗3遍,而后按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作,最終提取的RNA以DEPC水溶解后加入DNase酶消化去除DNA,并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度與純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

        1.2.5引物合成 ND1、COXⅠ、t3-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)人線(xiàn)粒體基因組序列(www.mitomap.org),應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)mtDNA上的3對(duì)引物,且以看家基因t3-aetin作為內(nèi)參照,并在BLAST上進(jìn)行同源性分析,引物核苷酸序列如下:ND1上游引物5′-AATCGCAATGGCATTCCTAA-3′,下游引物5′-GTAGAGGGTGATGGTAGATGTG-3′,長(zhǎng)度229 bp;COXⅠ上游引物5′-TACCCATCATAATC GG A G GC-3′,下游引物5′-ATAGCAGATGCGAGCAGGAG-3′,長(zhǎng)度223 bp;t3-actin上游引物5′-ACTTAGTT GCGAC ACC CrnC-3′,下游引物5′-GACTGCTGTCACCTTCACCG-3′,長(zhǎng)度162 bp。

        1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測(cè)ND1及COXⅠ mRNA的表達(dá) 定量檢測(cè)線(xiàn)粒體基因表達(dá)。反應(yīng)體系25 mol/L:2×SYBR green 12.5 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各0.2 μL,補(bǔ)雙蒸水至25 μL,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min后進(jìn)行下述40個(gè)循環(huán),95 ℃變性15 s,60 ℃退火和延伸1 min。由于本研究使用的是相對(duì)定量方法,所以必須觀察融解曲線(xiàn)來(lái)優(yōu)化引物含量。

        2 結(jié) 果

        2.1細(xì)胞形態(tài) 分選新鮮結(jié)腸癌細(xì)胞、HT-29細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞中CD44+分別為2.1%、4.0%及4.6%,后繼實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞生長(zhǎng)良好,見(jiàn)圖1。

        2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)其生物學(xué)特征 結(jié)腸癌細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞、HT-29細(xì)胞中CD44及CD133表達(dá)同時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞百分率僅為0%、1.8%及2.1%,見(jiàn)圖2。

        2.3各組ND1 mRNA的表達(dá)情況 與CD44-比較, CD44+的結(jié)腸癌細(xì)胞ND1 mRNA的表達(dá)水平升高了300%,HCT-116細(xì)胞升高了400%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而HT-29細(xì)胞只升高了5%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3、4。

        圖1 各組CD44+細(xì)胞形態(tài)

        圖2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組CD133/CD44陽(yáng)性表達(dá)情況

        圖3 各組ND1 mRNA PCR電泳情況

        *:P<0.05,與CD44-細(xì)胞比較

        圖4各組ND1 mRNA的表達(dá)情況

        圖5 各組COXⅠ mRNA PCR電泳情況

        2.4各組COXⅠ mRNA的表達(dá)情況 與CD44-比較, CD44+的結(jié)腸癌細(xì)胞COXⅠ mRNA的表達(dá)水平升高了350%,HT-116細(xì)胞升高了300%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而HT-29細(xì)胞無(wú)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖5、6。

        *:P<0.05,與CD44-比較

        圖6各組COXⅠ mRNA的表達(dá)情況

        3 討 論

        腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為[7-9]:腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性,其中一小群具有自我更新、無(wú)限增殖能力和不定分化潛能的腫瘤細(xì)胞即為腫瘤干細(xì)胞,是腫瘤形成的起始細(xì)胞,并維持腫瘤的生長(zhǎng);腫瘤干細(xì)胞對(duì)放療及化療藥物不敏感[10-11],可能是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源。目前絕大多數(shù)常見(jiàn)惡性腫瘤的腫瘤干細(xì)胞分離已取得成功,本實(shí)驗(yàn)選取37例新鮮結(jié)腸癌患者病理標(biāo)本及兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞系。HT-29是人高分化結(jié)腸癌細(xì)胞,易形成球形,用于觀察腫瘤細(xì)胞間細(xì)胞連接與免疫細(xì)胞作用;HCT-116是人來(lái)源結(jié)腸癌細(xì)胞,處于結(jié)腸癌分化早期階段,更接近于干細(xì)胞特性;以CD44表面抗原為基礎(chǔ),聯(lián)合CD133表面抗原,以腫瘤干細(xì)胞特有和必需的生物學(xué)特性,證實(shí)腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、增殖分化能力、強(qiáng)致瘤性及遺傳穩(wěn)定性,分離、鑒定了結(jié)腸癌干細(xì)胞,為下一步分子生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

        人們對(duì)線(xiàn)粒體的認(rèn)識(shí)已不再停留在“細(xì)胞能量工廠”的最初階段,目前的研究認(rèn)為線(xiàn)粒體還參與氧化損傷、細(xì)胞凋亡和人類(lèi)進(jìn)化,甚至與一些慢性退行性疾病和多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)。近年來(lái),越來(lái)越多的關(guān)于線(xiàn)粒體的研究已深入到線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔道、線(xiàn)粒體膜點(diǎn)位、Ca2+負(fù)荷、氧化損傷、凋亡前體分子、線(xiàn)粒體基因組穩(wěn)定性、線(xiàn)粒體DNA缺失及拷貝數(shù)變化等方面[12],但有關(guān)線(xiàn)粒體基因表達(dá)方面的研究較少。研究表明,放射可誘導(dǎo)人線(xiàn)粒體COXⅠ、ND1和ND6表達(dá)升高[13]。結(jié)腸癌發(fā)生與線(xiàn)粒體細(xì)胞色素氧化酶COXⅠ缺乏與突變有關(guān)[14-15]。本研究結(jié)腸癌干細(xì)胞線(xiàn)粒體呼吸氧化系統(tǒng)酶指標(biāo)明顯升高,代謝更加活躍,干細(xì)胞需要能量及需氧量更加旺盛,阻斷ND1或COXⅠ的表達(dá)有可能會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此,抑制線(xiàn)粒體呼吸系統(tǒng)酶活性有望成為治療腫瘤的又一潛在指標(biāo)。

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