張少為，陳 閣，張耀中，米 源，廖海江，王 雷

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸心外科，石家莊 050011)

食管癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其在全球所有惡性腫瘤的發(fā)病率占第八位，病死率占第六位。我國(guó)是食管鱗癌高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)病率和病死率均居世界第一位，在國(guó)內(nèi)食管癌位居全部惡性腫瘤死亡第四位[1]。目前傳統(tǒng)治療方法主要是手術(shù)切除輔助放化療，但食管癌在被確診時(shí)多是中晚期，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的比例高，預(yù)后不佳。食管癌發(fā)病機(jī)制與原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)，因此從基因分子水平闡明其發(fā)生機(jī)制是目前研究熱點(diǎn)。PLK1(polo-like kinase)作為絲氨酸-蘇氨酸激酶家族之一，是細(xì)胞有絲分裂關(guān)鍵的調(diào)控因子，其在啟動(dòng)、維持和有絲分裂的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究表明PLK1在黑色素瘤、皮膚梅克爾細(xì)胞癌、胰腺癌和肝癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[2-5]，下調(diào)PLK1表達(dá)可以通過(guò)減少細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡等機(jī)制起到明顯抗腫瘤作用。目前全世界關(guān)于PLK1 與食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間相關(guān)的研究較少。本研究通過(guò)沉默PLK1基因表達(dá)，探討其與食管鱗癌腫瘤生物學(xué)行為的分子機(jī)制，旨在為食管鱗癌的靶向治療提供一個(gè)新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE-30購(gòu)自上海通派生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司；Ham和RPMI1640 培養(yǎng)液購(gòu)自上海鈺森生物技術(shù)有限公司；SilencerTMSelect PLK1和control siRNA購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；TaqMan?PLK1引物和探針(Hs00983227_m1)和TaqMan?GAPDH(Hs02758991_g1)購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；75%酒精購(gòu)自北京華興科諾公司；LipofectamineTMRNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑盒和Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；iScriptTMcDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；TaqMan?基因表達(dá)預(yù)混液購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；結(jié)晶紫購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；2X Laemmli Sample Buffe、Tris/甘氨酸/蛋白電泳緩沖液和Mini-PROTEAN TGX 預(yù)制膠購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司；鼠抗人Vimentin 和GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人PLK1和C-myc單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗人MMP2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；West Femto最高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；Pierce-BCA 蛋白分析試劑盒購(gòu)自上海創(chuàng)賽科技有限公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；甲醇購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑有限公司；Transwell膜嵌套、matrigel 膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將食管鱗癌KYSE-30細(xì)胞用RPMI 1640 和Ham細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)液在37 ℃、CO2維持在5%左右的恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)80%左右并將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的食管鱗癌KYSE-30細(xì)胞接種到6孔板上，按照轉(zhuǎn)染說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染并設(shè)立PLK1 siRNA組及空白對(duì)照Control siRNA組，終濃度均為100 nmol/L，轉(zhuǎn)染完成后再培養(yǎng)48 h。

1.2.2Real time熒光定量PCR法檢測(cè)PLK1 mRNA的表達(dá) 首先進(jìn)行總RNA的提取，用PBS洗滌轉(zhuǎn)染好的食管鱗癌KYSE-30細(xì)胞，參照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取每組的總RNA，純化RNA上機(jī)檢測(cè)RNA濃度。然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參照iScriptTMcDNA合成的說(shuō)明書進(jìn)行每組樣本cDNA的反轉(zhuǎn)錄，在25 ℃5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min的條件下進(jìn)行cDNA合成并保存?zhèn)溆谩Ｗ詈筮M(jìn)行Real time熒光定量PCR擴(kuò)增，將Taqman基因表達(dá)預(yù)混液、TaqMan?PLK1物和探針0.5 μL或TaqMan?GAPDH引物和探針、樣本cDNA，上機(jī)在95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH的Ct值為標(biāo)準(zhǔn)，用2-ΔCt法進(jìn)行分析。

1.2.3Western blot檢測(cè)PLK1蛋白的表達(dá) PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h后KYSE-30細(xì)胞加到6孔板上，每孔總蛋白提取試劑100 μL并含有蛋白酶抑制劑的M-PER細(xì)胞，收集樣本的總蛋白提取液并離心取上清液，用BCA 法測(cè)定樣本的總蛋白濃度。再轉(zhuǎn)印槽中加上Tris/甘氨酸/蛋白電泳液，在Mini-PROTEAN TGX 預(yù)制膠中行每組樣本蛋白上樣，進(jìn)行電泳。用雙蒸水沖洗凝膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中轉(zhuǎn)至PVDF膜(冰浴)，室溫含5%脫脂奶粉的TBST液封膜1 h，加入一抗PLK1(1∶1 000)、一抗C-myc(1∶1 000)、一抗Vimentin(1∶10 000)、一抗GAPDH(1：20 000)、一抗MMP2(1∶1 000)、4 ℃搖床孵育過(guò)夜。第2天TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，將發(fā)光底物滴于PVDF膜上，5 min后于暗室曝光顯影，用 Image軟件對(duì)蛋白灰度值進(jìn)行分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化 將轉(zhuǎn)染48 h的KYSE-30細(xì)胞用PBS洗滌，胰酶消化，PBS漂洗，離心，吹打均勻重懸細(xì)胞，加入4 ℃70%冰乙醇固定30 min以上。PBS去除乙醇，重懸細(xì)胞并加碘化丙啶和RNaseA的PBS，避光4 ℃染色。尼龍網(wǎng)過(guò)濾后用MuticycleAV分析軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析，PI 激發(fā)波長(zhǎng)488 nm。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 液化Matrigel膠于聚碳酸酯膜。將轉(zhuǎn)染48 h的KYSE-30細(xì)胞加入Transwell小室上室。下室加10%PBS的細(xì)胞培養(yǎng)液，于恒濕恒溫箱中進(jìn)行孵育，24 h后將靠近內(nèi)室一面的基質(zhì)膠和細(xì)胞去掉，室溫甲醇固定30 min，最后用0.1%結(jié)晶紫染色清水漂洗晾干膜，緊接著在顯微鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1Real time熒光定量PCR法檢測(cè)PLK1 mRNA的表達(dá) PLK1 siRNA組PLK1 mRNA表達(dá)0.29±0.03較Control siRNA 組1.00±0.02明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=37.90，P=0.000)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組PLK1 mRNA的表達(dá)情況

2.2Western blot 檢測(cè)PLK1蛋白的表達(dá) PLK1 siRNA組PLK1、 C-myc、Vimentin、MMP2蛋白表達(dá)較Control siRNA組均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.72、24.57、25.15、8.85，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化 PLK1 siRNA組G2/M、S期細(xì)胞與Control siRNA組比較明顯降低(P<0.05)，G0/G1期細(xì)胞無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化

2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 與Control siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(94.00±4.04)個(gè)比較，PLK1 siRNA組(44.00±4.51)個(gè)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.30，P=0.000)，見(jiàn)圖3。

A:Contor siRNA組；B：PLK1 siRNA組

圖3兩組細(xì)胞侵襲能力的變化(×400)

3 討 論

PLKs是絲氨酸/蘇氨酸激酶，家族中包括從PLK1到PLK5，在細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相的調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。其中PLK1作為細(xì)胞周期檢控點(diǎn)的主要調(diào)節(jié)者，在有絲分裂過(guò)程與紡錘體形成及染色體的分離具有密切關(guān)系，此外，研究表明PLK1的高表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可以作為一個(gè)潛在的有效抗腫瘤靶點(diǎn)[6-8]。RNA干擾技術(shù)屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，可以使靶基因mRNA沉默達(dá)到定向敲除與腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因的功效，因其具有高特異性和高效性等特點(diǎn)作為一種嶄新的實(shí)驗(yàn)方法被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究及腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的分析。本研究應(yīng)用siRNA沉默KYSE-30細(xì)胞PLK1基因表達(dá)，結(jié)果顯示KYSE-30細(xì)胞中存在PLK1高表達(dá)，RNA干擾可明顯減少腫瘤細(xì)胞PLK1 mRNA和蛋白表達(dá)。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，受細(xì)胞周期蛋白、多種激素、細(xì)胞周期蛋白激酶、 三磷酸肌醇(IP3)、Ca信使系統(tǒng)及細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑等多個(gè)蛋白共同調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞周期紊亂可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖。PLK1 作為細(xì)胞周期依賴性激酶，在細(xì)胞有絲分裂調(diào)節(jié)過(guò)程中可以通過(guò)促進(jìn)中心體成熟、細(xì)胞周期由G2期進(jìn)入M期及染色體分離等功能發(fā)揮重要作用。阻止癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡是腫瘤基因治療的基本原則，AMANI等[9]采用PLK1靶向抑制劑BI 6727處理神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)顯著阻滯細(xì)胞于G2/M期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡增加。本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了轉(zhuǎn)染PLK1 siRNA對(duì)KYSE-30細(xì)胞的周期分布變化的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組較空白對(duì)照組相比可將更多細(xì)胞阻滯于G2/M期，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖，這與AMANI等的結(jié)果相一致。TAN等[10]研究發(fā)現(xiàn)PLK1是腫瘤細(xì)胞中PDK1-PLK1-Myc通路的核心成分，活化狀態(tài)的PLK1進(jìn)一步激活Myc促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)增殖和分化。筆者同時(shí)檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白C-myc的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步探討食管鱗癌細(xì)胞PLK1表達(dá)和周期變化的可能機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默PLK1基因后PLK1和C-myc蛋白表達(dá)下調(diào)，表明在食管鱗癌細(xì)胞周期調(diào)控中PLK1發(fā)揮重要作用，其可以通過(guò)上調(diào)C-myc表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮來(lái)源的惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，主要以E-Cadherin等上皮表型標(biāo)志下調(diào)[11]，Vimentin等間質(zhì)表型特征分子表達(dá)上調(diào)為特征[12-13]。Vimentin可以通過(guò)調(diào)節(jié)MT1-MMP改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的黏附及遷移能力，并且與患者的預(yù)后密切相關(guān)，下調(diào)Vimentin表達(dá)可以影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[14]。此外，細(xì)胞外基質(zhì)的降解也是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移重要的一部分，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)破壞細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)散并浸潤(rùn)到周圍正常組織，MMP2是鋅結(jié)合內(nèi)肽酶家族成員之一，高表達(dá)的MMP2在多種腫瘤組織中可以通過(guò)降解、破壞腫瘤附近的細(xì)胞基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[15-16]。本研究表明抑制PLK1表達(dá)后可導(dǎo)致Vimentin和MMP2蛋白表達(dá)下調(diào)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，可以說(shuō)明敲掉PLK1基因后可以抑制腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并減少了MMP2介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，從而降低食管鱗癌細(xì)胞的侵襲能力，分析其原因可能是PLK1通過(guò)誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的EMT過(guò)程促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PLK1在食管鱗癌細(xì)胞的異常增殖和促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是具體的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，PLK1有望成為食管鱗癌分子靶向治療的重要靶標(biāo)。