黃 靜，楊英花，張國剛，賈美清，韓國棟

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室，天津 300387；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010019）

氮沉降和氣候變暖已成為全球氣候變化的2個主要特征[1].到21世紀末陸地氣候會繼續(xù)變暖，平均地表溫度將升高1.8～4.0℃[2].20世紀由于人類活動導(dǎo)致的大氣氮沉降已增加了3～5倍[2]，據(jù)預(yù)測到2050年氮沉降的速率將會翻一番[3].Jia等[4]基于1980—2010年公開發(fā)表數(shù)據(jù)的分析表明，中國大氣氮沉降的平均值已由每公頃11.11 kg上升到每公頃13.87 kg，增加了近25%.在全球氣候變暖的大環(huán)境下，近50 a我國草原區(qū)氣候明顯變暖[5]，內(nèi)蒙古草原生態(tài)系統(tǒng)的氮沉降量也已達到了每年0.4～0.6 g/m2[6]，氮沉降和氣候變暖已成為內(nèi)蒙古草原面臨的主要環(huán)境問題.內(nèi)蒙古荒漠草原屬于典型草原向荒漠過渡的植被類型，是內(nèi)蒙古草原的重要組成部分，在畜牧業(yè)生產(chǎn)和維持生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要作用.近年來，由于氣候變化以及過度放牧等人為干擾，荒漠草原出現(xiàn)了嚴重退化，草地的服務(wù)功能受到了嚴重威脅.

土壤微生物直接參與土壤的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，在土壤碳循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[7].目前，氣候變化對荒漠草原影響方面的研究以地上植物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性居多[8-9]，在土壤特性[10]、土壤呼吸[11]等方面也取得了一些研究成果.土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是實現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)功能的重要因素.本課題組前期對內(nèi)蒙古荒漠草原土壤微生物的空間分布特征進行了初步研究[12-14].為了實現(xiàn)氣候變化大背景下對荒漠草原的合理管理和可持續(xù)利用，本研究通過人工施肥模擬氮沉降和遠紅外線輻射器加熱模擬氣候變暖，經(jīng)過連續(xù)6 a的模擬實驗后，采用稀釋平板涂布法和16S rRNA分子鑒定技術(shù)探究了氮沉降和氣候變暖對內(nèi)蒙古荒漠草原土壤可培養(yǎng)細菌群落組成和多樣性的影響.

1 材料與方法

1.1 樣地概況和設(shè)計

樣地位于內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市農(nóng)牧科學(xué)院四子王旗實驗站內(nèi)（41°47′17″N， 111°53′46″E）， 該地區(qū)為中溫帶大陸性季風(fēng)氣候.海拔1 456 m，多年平均降水量為248 mm，其中6—9月份的降水量占全年總降水量的70%以上，年均蒸發(fā)量為2 947 mm，多年平均氣溫3.4℃.植被類型是以短花針茅（Stipa breviflora）為建群種的荒漠草原，伴生種有木地膚（Kochiaprostrata）、無芒隱子草（Cleistogenes songorica）和冷蒿（Artemisia frigida）等.

如文獻[14]所述，于2006年5月在野外自然條件下開始增溫和氮沉降的模擬實驗.采用二因素完全隨機區(qū)組裂區(qū)設(shè)計，設(shè)置12個3 m×4 m的實驗區(qū).為了避免干擾，實驗區(qū)間設(shè)置了緩沖帶（3 m×3 m）.隨機對其中的6個實驗區(qū)進行增溫處理.對每個實驗區(qū)的一半進行增氮處理，另一半不進行增氮處理，在增氮和不增氮處理間設(shè)有30 cm深的物理隔離.共計24個小區(qū)，即不增氮不增溫（N0W0）、增氮不增溫（N1W0）、不增氮增溫（N0W1）和增氮增溫（N1W1）4個處理，每個處理6次重復(fù).在每個增溫實驗區(qū)的中央部位距地面2.25 m垂直高度處安裝一臺功率為2 kW的遠紅外線輻射器，不間斷地進行加熱以模擬增溫處理.為降低誤差，在不增溫小區(qū)距地面2.25 m處也安裝1臺鐵皮制的與遠紅外線輻射器大小相同的“假燈”.采用每年6—7月份雨季人工施加NH4NO3的方式（每年每平方米施加10g）模擬增氮.對不增氮不增溫（N0W0）、增氮不增溫（N1W0）和增氮增溫（N1W1）3個處理進行分析.

1.2 樣品采集和處理

2012年8月，用直徑5 cm的土鉆在每個實驗小區(qū)隨機采集0～30 cm的土樣，經(jīng)充分混勻后將其均分為2份，用塑料封口袋密封，低溫4℃下運回實驗室.其中一份立即進行土壤含水量的測定，另一份置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3 主要儀器和試劑

1.3.1 儀器

PCR擴增儀（TC-960F），瑞士Blue Marlin公司；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+），美國Bio-Rad公司；人工氣候箱（PQX-250H），廊坊市中儀國科儀器儀表有限公司.

1.3.2 試劑

孟加拉紅培養(yǎng)基、Taq Es DNA聚合酶、土壤DNA提取試劑盒和BBI染液，生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.4 土壤可培養(yǎng)細菌的分離培養(yǎng)

制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對土壤細菌進行培養(yǎng).取1 g經(jīng)充分混勻的新鮮土壤樣品于裝有100 mL無菌水的錐形瓶中，150 r/min下震蕩20 min.取此濃度的土壤混懸液進行梯度稀釋，以平板培養(yǎng)的菌落數(shù)為30～300個為便于計數(shù)的濃度，確定土壤混懸液的最佳質(zhì)量濃度為1×10-4g/mL.取200 μL土壤混懸液，用涂布器均勻涂布于平板（Φ=90 mm）上，同一樣品分別設(shè)置3個重復(fù)，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d.根據(jù)文獻[15]，按照菌落特征經(jīng)初步分類和編號后進行菌落計數(shù).最后挑取不同菌種的代表性菌落進行分離與純化.

1.5 土壤可培養(yǎng)細菌的分子鑒定

1.5.1 土壤可培養(yǎng)細菌的16S rRNA PCR擴增

用土壤DNA提取試劑盒提取可培養(yǎng)細菌菌落的DNA并進行PCR擴增，所用引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′） .PCR 擴增體系為 50 μL：10×Es Buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）各 4 μL，上、 下游引物各2 μL，Tap Es DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL， DNA 模板（10 ng/μL）1 μL， 用超純水補足至50 μL.PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min后進行30次擴增循環(huán)，即94℃變性1 min、55℃退火45 s、72℃延伸45 s，72℃延伸10 min.擴增后的PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，電泳時間為25 min.

1.5.2 土壤可培養(yǎng)細菌的分子鑒定

將電泳能夠檢測到條帶的可培養(yǎng)細菌的16S rRNA擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中進行比對，下載高質(zhì)量的序列進行后續(xù)分析.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel和Sigmaplot12.5進行數(shù)據(jù)錄入和圖表處理.采用SPSS13.0進行單因素方差（One-WayANOVA）分析，利用Tukey HSD比較不同處理中可培養(yǎng)細菌的數(shù)量和多樣性指數(shù)的差異.利用Bio-dap軟件計算可培養(yǎng)細菌的多樣性指數(shù)，包括物種豐富度指數(shù)（S）、香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)（H′）、均勻度指數(shù)（E）和相對豐度（Relative abundance），計算公式如下：

式中：Ni為每一個樣點分離出的全部種屬的數(shù)目.

式中：Pi為第i種個體數(shù)占樣品總個體數(shù)N的比例，Pi=ni/N，ni是第i種的菌株數(shù)，N是所有個體數(shù)的和.

式中：Hmax=ln S；H′為實際觀察的香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)；Hmax為最大的香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)；S為物種豐富度指數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤可培養(yǎng)細菌的種屬特征

從內(nèi)蒙古短花針茅荒漠草原土壤中共分離獲得14種細菌，根據(jù)可培養(yǎng)細菌菌落16S rRNA序列分析結(jié)果和細菌鑒定手冊[15]，這些細菌分別隸屬于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），如表1所示.

表1 可培養(yǎng)細菌菌株16S rRNA基因序列與最相似菌株的相似性Tab.1 Similarity of 16S rRNA gene sequence between the isolated cultivable bacteria and their closest strains

分離到的14種細菌中，有8種隸屬于厚壁菌門，代表性菌株編號分別為XJ2（芽孢桿菌，Bacillus sp.CRRI-93_SW Azo）、XJ11（類芽孢桿菌，Paenibacillus castaneae）、XJ19（Uncultured Trichococcussp.QRSYY9）、XJ21（葡萄球菌，Staphylococcus sp.AJAR-J1）、XJ35（梭菌，Clostridium sp.）、XJ40（芽孢桿菌，Bacillus subtilis strainCYBS-19）、XJ43（芽孢桿菌，Bacillus sp.KT15）和XJ44（芽孢桿菌，Bacillus sp.W30）.其中，XJ2、XJ40、XJ43和XJ44隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），XJ11隸屬于類芽胞桿菌屬（Paenibacillus），XJ19隸屬于Trichococcus屬，XJ21隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），XJ35隸屬于梭菌屬（Clostridium）.XJ15（假單胞菌，Pseudomonas sp.R-45822）隸屬于γ-變形菌綱假單胞菌屬（Pseudomonas）.XJ5（金黃桿 菌 ，Chryseobacterium sp.）和 XJ9（金黃桿菌，Chryseobacterium sp.S63.04.P.COS.HB.H.Ulcer.D.M）隸屬于擬桿菌門金黃桿菌屬（Chryseobacterium），XJ13（Pontibacter sp.Al-Dhabi-10）隸屬于擬桿菌門Pontibacter屬.XJ10（棒形桿菌，Uncultured Clavibacter sp.）隸屬于放線菌門Clavibacter屬， XJ39（雙歧桿菌，Uncultured Bifidobacterium sp.）隸屬于放線菌門雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）.除XJ39外，其他分離獲得的代表性菌株與GenBank中序列最相似菌種的相似性均≥97%，XJ39可能是潛在的新種.

2.2 增氮和增溫處理對土壤可培養(yǎng)細菌數(shù)量、群落組成和多樣性的影響

不同處理下，短花針茅荒漠草原土壤可培養(yǎng)細菌的數(shù)量、群落組成和多樣性如表2所示.

表2 不同處理中土壤可培養(yǎng)細菌的數(shù)量、群落組成及相對豐度Tab.2 Quantity，community composition and the relative abundance of the cultivable bacteria in different treatments

由表2可以看出，增氮不增溫和不增氮不增溫處理小區(qū)中的可培養(yǎng)細菌物種數(shù)均為12種.XJ2（厚壁菌門芽孢桿菌屬）、XJ35（梭菌屬）和 XJ15（γ-變形菌綱假單胞菌屬）是不增氮不增溫處理中的優(yōu)勢種，其相對豐度分別為14.03%、45.22%和15.50%.經(jīng)增氮不增溫處理后，XJ2、XJ35和XJ15的相對豐度沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05），分別為15.67%、39.12%和8.03%.與不增氮不增溫處理相比，增氮不增溫處理顯著增加了XJ13（擬桿菌門Pontibacter屬）的相對豐度（P＜0.05），由5.72%上升到8.77%.另外，經(jīng)增氮不增溫處理后，XJ11（厚壁菌門類芽孢桿菌屬）和XJ44（芽孢桿菌屬）出現(xiàn)，XJ39（放線菌門雙歧桿菌屬）和XJ43（厚壁菌門芽孢桿菌屬）消失.

與不增溫不增氮處理相比，增溫增氮處理使XJ2和XJ35的相對豐度降低，XJ2的相對豐度由14.03%降至7.52%，XJ35的相對豐度由45.22%降至26.78%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）.XJ15和XJ40（厚壁菌門芽孢桿菌屬）的相對豐度均顯著升高（P＜0.05），XJ15的相對豐度由不增氮不增溫處理的15.50%升高到增氮增溫處理的41.02%，并且成為增氮增溫處理中的優(yōu)勢種，XJ40的相對豐度由不增氮不增溫處理中的0.51%升高到增氮增溫處理的8.17%.另外，XJ21（厚壁菌門葡萄球菌屬）、XJ39、XJ43在增氮增溫處理中消失.總的來看，增氮不增溫處理和增氮增溫處理使土壤中可培養(yǎng)細菌的總數(shù)增加，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）.

不同處理下短花針茅荒漠草原土壤可培養(yǎng)細菌的多樣性如圖1所示.由圖1可以看出，增氮不增溫降低了可培養(yǎng)細菌的物種豐富度指數(shù)（S），但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）.增氮不增溫和增氮增溫處理對可培養(yǎng)細菌的香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)（H′）、均勻度指數(shù)（E）均沒有產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）.

圖1 不同處理0～30 cm土層中可培養(yǎng)細菌的多樣性Fig.1 Diversity of the cultivable bacteria in different treatments at 0-30 cm soil depth

3 討論與結(jié)論

3.1 增氮不增溫對土壤可培養(yǎng)細菌群落組成和多樣性的影響

不同研究中增氮對土壤細菌數(shù)量的影響存在差異.Sarathchandra等[16]對多年生牧草草地的研究結(jié)果顯示，增氮對細菌總數(shù)沒有影響.施瑤等[17]在內(nèi)蒙古典型草原連續(xù)6 a的氮磷添加實驗結(jié)果表明，隨著氮添加量的增加，土壤細菌PLFA生物標記數(shù)量表現(xiàn)出上升趨勢.譚成玉[18]對東北羊草草原進行連續(xù)2 a的增溫和增氮實驗，結(jié)果顯示，增氮使細菌數(shù)量增加了16%.本研究對內(nèi)蒙古短花針茅荒漠草原的土壤細菌進行增氮增溫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增氮不增溫處理增加了可培養(yǎng)細菌的數(shù)量，但是與不增氮不增溫處理相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）.Frey等[19]研究表明，長期增氮會造成土壤酸化，破壞其結(jié)構(gòu)，進而影響微生物的生存.本實驗區(qū)的增氮不增溫處理對0～30 cm土壤的pH基本沒有影響，所以推測增氮造成的土壤酸化和對結(jié)構(gòu)的破壞可以忽略.Craine等[20]的微生物氮礦化假說認為，土壤微生物利用易分解的碳來降解有機物以獲得氮，這一過程受氮的可利用性的限制.李元恒[21]的研究表明，增氮效應(yīng)增加了實驗區(qū)的地下凈初級生產(chǎn)力.本研究中，增氮并未使土壤細菌數(shù)量顯著增加，究竟是因為植物與土壤微生物對氮的可利用性存在競爭關(guān)系，還是因為氮的礦化，或者是二者的共同作用，這有待于進一步研究.

增氮對微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響在不同研究中也存在分歧.劉昭霞[22]對添加氮后的稀樹草叢土壤細菌的研究表明，增氮能夠增加土壤細菌的多樣性和豐富度.隋心等[23]對三江平原濕地土壤細菌的研究表明，氮添加能夠增加土壤細菌的群落多樣性.楊山等[24]對典型溫帶草原的氮添加實驗表明，增氮對土壤細菌的豐富度指數(shù)、均勻度指數(shù)和香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)均沒有顯著影響.這可能與增氮的量、增氮持續(xù)的時間長度、研究方法及生態(tài)系統(tǒng)等有關(guān).Zeng等[25]研究認為，增氮既能夠直接影響微生物的多樣性，還可以通過土壤pH值和植物群落的改變間接影響微生物的群落結(jié)構(gòu).本研究中，增氮不增溫處理改變了可培養(yǎng)細菌的群落結(jié)構(gòu)，但對于可培養(yǎng)細菌的總數(shù)、物種豐富度、均勻度和香農(nóng)-威納物種多樣性指數(shù)均沒有顯著影響.

3.2 增氮增溫對土壤細菌的影響

增溫增氮對土壤微生物的影響也沒有統(tǒng)一結(jié)論.Rinnan等[26]對苔原土壤微生物的研究表明，增溫能抑制細菌生長.高金濤[27]對中亞熱帶杉林土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，增溫增氮同樣會抑制細菌生長.譚成玉[18]對松嫩草原土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，增溫增氮能夠使細菌數(shù)量增加11%.Shen等[28]連續(xù)5 a的增溫增氮實驗表明，增溫增氮的交互作用對土壤微生物幾乎沒有影響.本研究中的增溫增氮處理對短花針茅荒漠草原土壤細菌的數(shù)量和多樣性也沒有顯著影響，但改變了土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)，厚壁菌門的XJ2和XJ35的相對豐度顯著降低，變形菌門的XJ15和厚壁菌門的XJ40的相對豐度顯著增加，尤其是XJ15成為土壤細菌中的優(yōu)勢種，這可能與生態(tài)系統(tǒng)、實驗地的特異性、增溫持續(xù)時間、增溫幅度等有關(guān).