鮑 鵬 ，余斯琦 ，蘇春玉 ，于東渤 ，朱長軍 ，董智雄

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3.天津師范大學 分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室，天津 300387）

生物體中，蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，也是最終執(zhí)行生物功能的分子.核仁是真核細胞內(nèi)核糖體生物發(fā)生的場所，它通過控制核糖體的生物發(fā)生調(diào)控細胞的各項基本生命活動[1-5].有研究發(fā)現(xiàn)，大量與核仁和核糖體生物發(fā)生途徑相關(guān)的蛋白在腫瘤中的表達水平升高，可用于腫瘤診斷、惡性程度判斷及預(yù)后等.如核仁蛋白NOP14在胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶中表達上調(diào)，可能通過促進腫瘤微血管形成導致胰腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[6-7]；核仁蛋白EBP2在肺癌細胞系中高表達，且它的過表達能促進肺癌細胞的增殖[8]；核仁蛋白PES1在乳腺癌組織中高表達，它與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，可作為乳腺癌的生物標記物[9-11].

常用于組織蛋白表達水平檢測的方法有Western blot、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、免疫熒光染色、免疫組織化學染色等.Western blot可以檢測樣品中是否存在目的蛋白的抗原、在組織中的含量及其抗原多肽鏈的相對分子質(zhì)量等，具有高效、簡便、靈敏等特點，但在檢測過程中經(jīng)常會出現(xiàn)非特異性條帶、膜本底差、顯色不好等問題，從而影響實驗結(jié)果.ELISA多用于定量分析，其靈敏度極高，可以定量檢測蛋白，直接讀出濃度，但如果抗體出現(xiàn)非特異性結(jié)合，則通過ELISA得到的數(shù)值可信度會降低，且該方法也無法檢測目的蛋白與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合情況.免疫熒光染色和免疫組織化學染色中，目前常用的是冰凍切片免疫熒光染色、石蠟切片免疫組織化學染色和石蠟切片免疫熒光染色.冰凍切片免疫熒光染色最突出的優(yōu)點是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，染色方法簡單、快速、敏感，容易重復(fù)，結(jié)果容易判斷，但冰凍組織塊很小，難以長期保存，因此無法用于回顧性分析研究[1].石蠟切片的優(yōu)點是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實用價值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準確.石蠟切片雖優(yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機溶劑的處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多.總之，組織蛋白表達的檢測方法很多，各有利弊，目前還沒有一個明確、統(tǒng)一的檢測方法.

本課題組通過檢索和分析Oncomine腫瘤基因數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，核仁蛋白RRP15與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達量在癌組織中上調(diào)了2.65倍.本研究制備了RRP15的特異性抗體，分別利用免疫組織化學染色和免疫熒光染色方法，檢測該蛋白在組織中的表達水平.以RRP15 mRNA的表達水平為參照，比較不同染色方法的優(yōu)劣性，從而為找到一種能夠快速、準確定量檢測組織蛋白表達水平的方法提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 材料

12例病例標本購置于武漢谷歌生物科技有限公司.

1.1.2 儀器

熒光共聚焦顯微鏡（Eclipse90i），日本Nikon公司；實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司.

1.1.3 試劑

特異性多克隆兔抗RRP15抗體，本實驗室自制；辣根過氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔抗體，美國Immuno公司；Trizol試劑盒，美國Invitrogen公司；免疫組化試劑盒，丹港生物科技有限公司；Ultra SYBR Mixture，北京康為世紀生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR檢測RRP15 mRNA的表達

使用Trizol試劑盒（操作參照說明書）提取腫瘤組織和正常組織的總RNA.取2 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括oligo dT 1 μL、dNTP 4 μL、5×buffer 4 μL、反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，加高壓水補足至20 μL，將上述樣品混勻，利用PCR儀進行擴增.反應(yīng)參數(shù)：25 ℃ 10 min；42 ℃ 1 h；95 ℃ 5 min；4℃保溫.合成cDNA后進行PCR反應(yīng)，檢測RRP15 mRNA的表達水平，以β-actin為內(nèi)參.PCR引物包括：RRP15 上游引物（5′-GGTAACTGGAGCCGTAG-3′）、下游引物（5′-GGACTTTAGCCATAGCAT-3′）；β-actin 上游引物（5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′）、β-actin下游引物（5′-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3′）.PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Ultra SYBR Mixture PCR緩沖液 10 μL、10 μmol/L 的上、 下游引物各 1 μL、cDNA模板1.5 μL，超純水補足至20 μL.反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃反變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共35個循環(huán).溶解曲線分析：95℃15s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s.

1.2.2 免疫組織熒光染色法

石蠟切片免疫組織熒光染色步驟如下：（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）將切片放入檸檬酸鈉緩沖液中，微波爐低火加熱 15 min，用 PBS 沖洗一次，5 min；（3）加入500 μL 封閉液，37 ℃孵育 20 min；（4）滴加稀釋的一抗工作液兔抗RRP15，37℃孵育2 h，用PBS沖洗3次；（5） 滴加 500 μL第二抗體，37℃濕盒孵育 1 h，用PBS 沖洗 3次；（6）滴加 500 μL 的 DAPI，37℃濕盒孵育5 min，用PBS洗3次，封片.

1.2.3 免疫組織化學染色法

石蠟切片免疫組織化學染色步驟如下：（1）切片常規(guī)脫蠟至水；（2）將切片放入檸檬酸鈉緩沖液中，中火煮沸8 min，?；? min，中低火煮7 min，用PBS洗一次；（3）將切片放入體積分數(shù)為3%的H2O2中，37℃避光孵育 25 min，PBS洗 3次；（4） 加入 500 μL 封閉液，37℃孵育10 min；（5）滴加稀釋的一抗工作液兔抗RRP15，4℃過夜；（6）PBS洗 3次，滴加 500 μL 兔抗生物素化二抗，37℃濕盒孵育10 min，PBS沖洗3次；（7）滴加500 μL HRP標記鏈親和素，37℃濕盒孵育10 min，PBS沖洗 3次；（8）滴加 400μL 新鮮配制的DAB顯色液作用7 min，水洗10 min，蘇木精復(fù)染1 min，用流水沖洗返藍，分化30 s，流水沖洗5 min，伊紅染色1 min，流水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，浸入二甲苯，自然晾干后，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察.

1.2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗進行分析，P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析RRP15蛋白在結(jié)腸癌中的表達

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析RRP15蛋白在多種癌癥中的表達情況，結(jié)果如圖1所示.由圖1可以看出，相對于正常結(jié)腸組織，RRP15蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達顯著升高，其表達量是正常組織中的2.65倍.

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)顯示RRP15在結(jié)腸癌中高表達Fig.1 High expression of RRP15 in colon cancer showed by oncomine data

2.2 Real-time PCR檢測RRP15在結(jié)腸癌中的表達

從12例結(jié)腸癌病人的癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織中選取RRP15為目的蛋白，利用Trizol法提取組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，進行Real-time PCR檢測，定量結(jié)果如圖2所示.由圖2（a）可以看出，在 12例病人中，1號、2號、5～8號、10～12號病例的結(jié)腸癌組織中，RRP15 mRNA的水平明顯高于癌旁組織，3號、4號、9號病例中的表達有不同程度的下調(diào).由圖2（b）可以看出，結(jié)腸癌組織中RRP15的表達量為癌旁組織的1.88倍.

圖2 RRP15 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達Fig.2 RRP15 mRNA expression in colon cancer tissues

2.3 免疫熒光染色法檢測RRP15在結(jié)腸癌中的表達

制備12例結(jié)腸癌病人的癌組織及癌旁組織的石蠟切片，進行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下以相同曝光時間進行圖像采集，之后用Image Pro Plus統(tǒng)計其熒光強度，結(jié)果如圖3所示.由圖3（a）和圖3（b）可以看出，在12例結(jié)腸癌病人中，1號、2號、6號、7號、8號、10號、11號、12號結(jié)腸癌組織中RRP15的熒光強度明顯高于癌旁組織，3號、4號、5號、9號結(jié)腸癌組織中的熒光強度則弱于癌旁組織，這與Real-time PCR的結(jié)果基本一致.綜合所有病例的結(jié)果可知，RRP15在結(jié)腸癌組織中的熒光強度是癌旁組織的1.29倍，如圖3（c）所示.

2.4 免疫組織化學染色法檢測RRP15在結(jié)腸癌中的表達

利用免疫組織化學染色法檢測12例結(jié)腸癌病人的癌組織及癌旁組織中RRP15的表達，結(jié)果如圖4所示.

圖3 免疫熒光染色檢測RRP15在結(jié)腸癌中的表達Fig.3 Detection of RRP15 expression in colon cancer tissues using immunofluorescence staining

圖4 免疫組織化學染色檢測RRP15在結(jié)腸癌中的表達Fig.4 Detection of RRP15 expression in colon cancer tissues using immunohistochemical staining

由圖4可以看出，在12例患者中，1號、2號、3號、5號、6號、8號、9號、10號、12號為陽性，4號、7號、11號為陰性.該種檢測方法中，3號、7號、9號、11號的檢測結(jié)果均與Real-time PCR的檢測結(jié)果不一致.

3 討論與結(jié)論

為了尋找一種簡便快捷、可靠的組織蛋白表達水平檢測方法，本研究以結(jié)腸癌患者腫瘤組織和正常組織中RRP15 mRNA的表達水平作為參照，比較免疫熒光染色法和免疫組織化學染色在檢測組織蛋白表達水平上的優(yōu)劣.結(jié)果顯示，石蠟切片免疫組織化學染色法和石蠟切片免疫熒光染色法都能對癌組織中蛋白的表達進行檢測，但后者準確率更高，而且通過統(tǒng)計染色后的熒光強度，可將蛋白水平進行量化，更直觀地反映出表達情況.

在腫瘤的臨床檢測與治療過程中，多種蛋白的表達水平與患者的疾病惡化程度判斷、臨床治療手段的選擇及預(yù)后等直接相關(guān).如NGAL蛋白與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)，當炎癥或腫瘤發(fā)生時組織內(nèi)的NGAL迅速升高，被認定為評價因炎癥或腫瘤形成而導致內(nèi)皮損傷嚴重程度的重要標志物[12-13].Survivin蛋白在多種泌尿系腫瘤中有表達，其高表達往往預(yù)示患者預(yù)后不良以及較高的復(fù)發(fā)率[14].由此可見，這些與癌癥發(fā)生發(fā)展、預(yù)后相關(guān)的蛋白在組織中精確的定量檢測至關(guān)重要.免疫熒光染色法能夠?qū)M織中的目的蛋白進行熒光標記，通過激光共聚焦顯微鏡對熒光標記的組織標本進行共聚焦熒光定量分析，或者通過采集圖像信息統(tǒng)計其熒光強度進行定量分析.而免疫組織化學染色法只能進行半定量的分析研究，而且其結(jié)果判斷主觀性較強，因此免疫組化法難以對某一蛋白進行精確的定量分析.

除此之外，石蠟切片免疫熒光雙重染色法既有冰凍切片免疫熒光染色抗原特異性高、敏感性強、能同時顯示表達于同一部位的2種抗原的特點，又具有石蠟切片免疫組化染色組織細胞結(jié)構(gòu)清晰、抗原定位準確的優(yōu)點，這對于某些癌癥中需要精確檢測目的蛋白的表達水平具有重要臨床意義.而免疫組化方法雖然具有特異性強、靈敏度高、方法簡單易行、圖像直觀、結(jié)果便于評價等優(yōu)點，但卻有很大的局限，例如一次只能檢測一個抗原、用多底物顯色系統(tǒng)標記后結(jié)果不容易區(qū)分、特別是表達在相同位置的2個抗原容易出現(xiàn)重疊因此結(jié)果不好判斷等.該方法也會受到分辨率的影響，在明場下，底物顏色和切片厚度都能影響到最終結(jié)果.另外，由于顯色底物是酶促反應(yīng)，很容易出現(xiàn)底物飽和的現(xiàn)象，因而限制了半定量分析[15].

綜上所述，免疫熒光染色檢測法是檢測組織中蛋白表達水平的首選方法，免疫組化染色可作為一種輔助方法.對于某些組織只需要檢測目的蛋白表達的有無或者表達的高低可以選擇方法更加簡便快捷的免疫組化，但對于需要準確定量分析蛋白表達水平，或者探究蛋白表達水平與某種疾病之間的關(guān)系，免疫熒光染色是必不可少的檢測手段.